槲皮素通过抑制氧化应激改善3×Tg-AD小鼠的认知功能障碍

杨宜歆，时 磊，赵 杨，王延虹，李艳艳

（郑州大学第五附属医院 郑州 450052）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）是一种难以治愈的神经退行性疾病，患者的认知功能受到严重的影响，伴随不可逆的记忆丧失，逐渐丧失自我照顾管理的能力[1]。AD 的主要病理特征是β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经元缠结[2-3]，且有研究表明Aβ 寡聚体具有较强的神经毒性，可以通过多种机制介导突触功能和数量异常，引起神经元死亡[4]。我国AD 患者人数逐年升高，发病率约为6.25/1000 人/年，且增速约为西欧和其他高水平地区的3 倍[5]。AD 是全球重要的公共卫生问题，给患者的家庭和社会带来巨大的负担。由于缺乏对AD 发病机制的了解，迄今尚没有逆转或阻止AD 病情进展的有效治疗药物。因此，深入探究AD 的发病机制，寻找潜在的治疗药物是亟需解决的问题。

越来越多的研究认为，氧化应激是导致衰老和包括AD 在内的多种神经退行性疾病发展的重要因素[6-7]。ROS 的产生与抗氧化防御之间的平衡是正常细胞功能所必需的。然而，在AD 中，抗氧化酶的活性受到抑制，氧化与抗氧化之间的平衡被打破，从而导致氧化损伤的无限制积累，最终引起细胞损伤[8]。

槲皮素（Quercetin，QT）是一种黄酮类化合物，广泛存在于苹果、浆果、洋葱和鲤鱼等许多水果和蔬菜中[9]。多项研究表明，槲皮素能发挥神经保护作用，对抗氧化应激。有研究表明，口服槲皮素（50 mg·kg-1）可以减轻被迫参与强迫游泳实验的大鼠海马和纹状体内氧化应激的增加[10]；Tang等人的研究表明，槲皮素可以抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症和氧化应激[11]。

3×Tg-AD 小 鼠 是 由 Oddo 等 人 建 立 的 含 PS1（M146V）、APP（Swe）和Tau（P301L）基因的三重转基因模型纯合子小鼠，小鼠可正常存活并具有生育能力，无先天性缺陷或异常行为[12]。该模型小鼠具有AD的主要病理学特征，β 淀粉样蛋白形成的斑块以及过度磷酸化形成的神经元缠结，并且这些病理特征在6月龄时就较为明显，是一种理想的AD动物模型[13]。因此我们选用3×Tg-AD 小鼠作为AD 的动物模型，深入探讨AD 的发病机制以及槲皮素在AD 中可能的作用，为AD 的发病机制提和槲皮素在AD 的中的潜在治疗作用提供新的证据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

将9 月龄的3×Tg-AD 小鼠和其同窝野生型对照小鼠随机分为4 组：野生型组（wildtype，WT）、野生型+QT 组（WT + QT）、模型组（3×Tg-AD）和模型小鼠+QT组（3×Tg-AD + QT），每组8 只。WT + QT 组和3×Tg-AD + QT 组的小鼠灌胃给予 QT 15 mg/kg/天，WT 组和3×Tg-AD 组的小鼠灌胃给予等体积溶剂，共治疗8周。第7 周进行行为学测试，在此期间继续给予如前药物治疗。

小鼠饲养在SPF 级动物房间，饲养温度为（25 ±2）°C，相对湿度约50%，明暗周期为12 h，可自由饮食饮水，定期更换垫料。对于实验动物进行的所有操作都遵守伦理规定，并经过本院实验动物管理和使用委员会的批准。

1.2 主要仪器及试剂

Morris水迷宫系统（北京众实），电子天平（赛多利斯）；电泳仪、电泳槽和转膜槽（美国Bio-Rad 公司）；化学发光成像仪（赛默飞，Invitrogen iBright）；多功能酶标仪（赛默飞，VarioskanLUX）；离心机（德国艾本德）。槲皮素（≥97%）购自于上海源叶生物科技有限公司；丙二醛（MDA）测试盒（A003-1-2）、总超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（A001-3-2）、一氧化氮（NO）测试盒（A012-1-2）和谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-Px）测试盒（A005-1-2）均购自于南京建成生物工程研究所。小鼠白介素1β（IL-1β）酶联免疫吸附测定试剂盒（EEL-M0037c）和小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（E-EL-M3063）购自于武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。Nrf2 抗体（16396-1-AP）、Keap1抗体（10503-2-AP）、β-actin（66009-1-lg）、HRP标记的羊抗兔IgG（SA00001-2）和HRP 标记的羊抗鼠IgG（SA00001-1）均购自于武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 水迷宫实验

水迷宫实验设备选用Morris 系统小鼠通用型设备，水池直径100 cm，深50 cm，水深25 cm，水温控制在22-24°C，水中加入白色染料，在水池壁的四个方向均匀设置不同的标记，使得水池被等分为四个象限。将直径6 cm的平台放置于第三象限水下2 cm处。

定位航行实验：将待测小鼠依次从四个象限入水点放入水中，记录小鼠60 s内寻找到平台的时间（逃避潜伏期）。如果小鼠在60 s内未找到平台，逃避潜伏期即为60 s；如果小鼠在60 s内找到平台，那么到达平台的时间即为小鼠的逃避潜伏期。逃避潜伏期的长短可以评价小鼠的空间学习能力。

空间探索实验：定位航行实验结束24 h 后，撤去平台，在第一象限相同的入水点将小鼠背向平台之前所在象限放入水中，记录小鼠在60 s 内穿越原平台的次数，以此评价小鼠的空间记忆能力。

1.3.2 血清中MDA、SOD和GSH-Px的含量

收集各组小鼠血液于抗凝管中，4°C、3000 rpm 离心5 min 分离血清与血细胞，根据试剂盒说明书步骤操作，检测各组血清中MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.3.3 ELISA检测IL-1β、TNF-α的含量

取适量小鼠脑组织于玻璃研磨器中研磨，加入预冷的生理盐水，制成10%的组织匀浆液，4°C、12000 rpm 离心10 min 收集上清，根据ELISA 试剂盒说明书进行操作，计算各组小鼠脑组织中IL-1β 和TNF-α 的含量。

1.3.4 NO含量检测

取上一步收集的脑组织上清，采用Griess 方法参照NO 试剂盒说明书进行操作，根据标准曲线计算得到各组样本中NO的含量。

1.3.4 Western Blot检测炎症通路蛋白

取小鼠脑组织于电子天平上称重后，置于玻璃研磨器中研磨，加入预冷的生理盐水，制成10%的组织匀浆液，于 4°C 离心机中 12000 rpm 离心 10 min，取沉淀物加入蛋白裂解液（每0.1 g 组织加入140 μL 裂解液），冰上裂解40 min，每10 min在涡旋仪上涡旋一次。于 4°C 离心机中 14000 g 离心 10 min，上清即为蛋白原液。BCA 试剂盒进行蛋白浓度定量，加入buffer 高温使蛋白变性后，分装保存于-20°C。

配制适宜浓度的SDS 凝胶，电泳，转膜，分割PVDF 膜，得到目的蛋白和内参条带，5%的脱脂奶粉室温下于 30 rpm 摇床上孵育 2 h 进行封闭，4°C 孵育Nrf2 一抗（1:1000）、Keap1 一抗（1:1000）或 β-actin 一抗（1:1000），过夜。TBST 洗膜3 次，10 min/次，之后与HRP 标记的二抗（1:1000）于室温条件孵育2 h，TBST再次洗膜3 次，10 min/次。在膜上均匀滴加ECL 发光液后置于凝胶成像仪中拍照，图片使用Image J 2.0 进行灰度值计算。

1.4 统计分析

实验结果以平均值 ± 标准差（mean ± SD）表示。采用one-way ANOVA 方差分析进行数据统计，任意组间差异使用Kruskal-Wallis 多重比较检验法进行分析，p＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 槲皮素改善3×Tg-AD小鼠的学习能力

在为期4 天的水迷宫训练中，各组小鼠都表现出一定的学习能力，随着训练时间的增加，各组小鼠的逃避潜伏期降低（图1A）。实验结果表明，与WT 组小鼠相比，3×Tg-AD 组小鼠逃避潜伏期降低的较慢，而3×Tg-AD+QT组小鼠的逃避潜伏期显著降低，二者之间的差异具有统计学意义（图1B）。

图1 槲皮素改善3×Tg-AD小鼠的学习能力

2.2 槲皮素提高3×Tg-AD小鼠的空间记忆能力

在水迷宫训练结束的24 h 后，撤去平台。3×Tg-AD 组小鼠的穿越虚拟平台次数明显低于WT 组小鼠，而3×Tg-AD+QT 组小鼠穿越虚拟平台的次数显著增加（图2），二者之间的差异具有统计学意义，说明槲皮素可以提高3×Tg-AD小鼠的空间记忆能力。

图2 槲皮素提高3×Tg-AD小鼠的空间记忆能力

2.3 槲皮素降低3×Tg-AD小鼠脑内氧化应激水平

与WT 组小鼠相比，3×Tg-AD 组小鼠血清中MDA含量升高（图3A），SOD 和GSH-Px 含量明显降低（图3B 和3C），说明3×Tg-AD 组模型小鼠脑内应激水平明显增加；而3×Tg-AD + QT 组小鼠血清中MDA 含量显著降低（图3A），SOD 和GSH-Px 含量显著升高（图3B、图3C），说明槲皮素可以抑制3×Tg-AD 模型小鼠脑内氧化应激水平。

图3 槲皮素抑制MDA水平，提高SOD与GSH-Px的水平

2.4 槲皮素降低3×Tg-AD 小鼠脑组织中NO、IL-β、TNF-α的水平

3×Tg-AD 组小鼠脑组织匀浆上清中NO（图4A）、IL-β（图4B）、TNF-α（图4C）的水平与WT 组小鼠相比均明显升高；而3×Tg-AD + QT 组小鼠脑组织中这些炎症因子的水平均明显降低，说明槲皮素可以抑制3×Tg-AD小鼠脑组织中炎症反应水平。

图4 槲皮素降低模型小鼠脑组织中NO、IL-β、TNF-α的水平

2.5 槲皮素上调3×Tg-AD 小鼠脑部Nrf2 的表达，抑制Keap1的表达

Western blot 实验结果表明，与WT 组相比，3×Tg-AD组小鼠脑组织中Keap1表达量显著升高，而Nrf2含量显著降低，从分子层面进一步证实3×Tg-AD 模型小鼠脑内发生氧化应激（图5）；而3×Tg-AD + QT 组中，Keap1 的表达被抑制，Nrf2 的含量升高，提示槲皮素可能通过调节Nrf2/Keap1 途径改善3×Tg-AD 小鼠氧化应激水平（图5）。

图5 槲皮素提高3×Tg-AD小鼠脑部Nrf2的水平，降低Keap1的表达

3 讨论

AD 的治疗在临床上进展缓慢，主要原因是AD 发病机制目前尚未被阐明。学者们提出了许多关于AD的假说，如Aβ 沉积形成老年斑、Tau 蛋白过度磷酸化导致神经元缠结等。近些年来，越来越多研究结果表明，氧化应激在AD 的发病机制中起着重要作用。机体在受到有害刺激时，ROS 及活性氮（RNS）等自由基过度堆积，机体内氧化与抗氧化之间的动态平衡被打破，表现为SOD 活性下降和/或MDA 含量升高，体内氧化/抗氧化平衡失调会引起信号传导通路异常激活，诱导细胞凋亡，引起组织损伤。李瑞天等人的研究表明，AD 患者血清中 SOD 和 GSH-Px 水平降低，MDA 显著升高[14]。同样的，赵仲艳等人的研究结果显示，AD患者中存在明显的氧化应激和自由基损伤的现象[15]。说明氧化应激在AD 的病理过程中可能发挥着重要的作用。我们的研究结果表明，3×Tg-AD 小鼠血清中MDA 水平升高，SOD 和 GSH-Px 水平降低，说明在 AD模型小鼠中发生了明显的氧化应激，这与其他学者前期的研究结果相吻合。

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，存在于许多水果和蔬菜中。苹果、樱桃、浆果、洋葱、芦笋和红叶莴苣中槲皮素含量最高[16]。关于氧化应激在神经退行性病变中的关键作用，人们普遍认为调节自由基的产生或减轻其有害影响可被作为预防和控制神经退行性疾病的一种潜在的治疗策略[17]。Wang 等人的研究表明，槲皮素可改善APPswe/PS1dE9 转基因小鼠模型的学习记忆和认知记忆，减少散在的老年斑形成，减轻线粒体功能障碍，表现为增加线粒体膜电位和ATP 水平，同时减少活性氧(ROS)的产生[18]。在Chen,Z.等人的研究中表明抗氧化剂可能有益于AD 的治疗[19]。Chen 等人发现 QT 可以降低 IRE1α 和 PERK 的磷酸化水平来抑制内质网应激，最终减弱SH-SY5Y 细胞中Tau 的磷酸化水平[20]；Liu 等人使用聚山梨酯 80 修饰QT，发现修饰后的QT 可以激活SH-SY5Y 细胞的自噬，促进自噬体和溶酶体的融合，加速Aβ 的清除，保护SH-SHY5Y 细胞免受Aβ 诱导的细胞毒性损伤[21]；Sun 等人的研究结果表明，纳米QT 可以抑制Zn2+-Aβ 42 系统的神经毒性，提高神经元活力，并且可以改善APP/PS1 小鼠的认知和记忆障碍[22]。我们的研究结果表明，3×Tg-AD + QT 组小鼠的逃避潜伏期明显低于3×Tg-AD 组小鼠，且在撤去平台之后，穿越平台次数也显著高于3×Tg-AD 组小鼠，说明槲皮素具有治疗AD 的潜在药理作用。同时3×Tg-AD + QT 组小鼠血清中 MDA 水平降低，SOD 和 GSH-Px 水平升高，说明槲皮素具有良好的抗氧化作用。

炎症是包括神经退行性疾病在内的多种疾病的一个主要特征，在AD 脑部存在明显的炎症现象，炎症造成的直接和间接损害会加剧AD 的发生和发展。因此，抑制炎症可能有助于减缓这种破坏性疾病的进展或延缓其发病[23-24]。超过15 项流行病学研究表明，非甾体抗炎药物在AD 中具有保护作用。这些流行病学有一个一致的发现，非甾体抗炎药在临床诊断前使用的时间越长，保留的效果就越大[25]。因此，抑制炎症可能成为治疗AD 的主要策略。Wang 等人的研究表明，槲皮素对心肺复苏大鼠模型的炎症有明显的抑制作用[26]。Chen 等人的研究发现槲皮素可通过阻断NF-κB 和 AP-1 信号通路，抑制肿瘤坏死因子-κ 诱导的细胞凋亡和炎症反应，从而发挥治疗冠心病的作用[27]。我们的研究结果显示，3×Tg-AD 组小鼠脑组织中NO、TNF-α、IL-1β 水平较WT 组均明显升高，而3×Tg-AD+ QT 组小鼠NO、TNF-α、IL-1β 较3×Tg-AD 组均明显下降，说明槲皮素可以抑制3×Tg-AD 组小鼠脑组织中炎症反应的发生。

Nrf2 介导的信号通路是机体内维持氧化应激、氧化还原平衡的重要信号通路。Nrf2 是负责调节机体抗氧化应激反应过程的核转录因子，能够通过与胞浆蛋白Keap1相互作用，诱导相关基因差异表达，包括具有抗氧化、抗炎及生物转化酶等功能的基因[28]。Nrf2被称为抗氧化反应的“主调节因子”，调控着数百个基因的表达，其中不仅包括常见的抗氧化酶，还包括大量控制免疫和炎症反应、组织重塑和纤维化、癌变和转移、甚至认知功能障碍和成瘾行为等不同过程的基因[29]。在一项研究中发现，AD 患者中存在氧化应激的现象，并且Nrf2 的表达水平下降[30]。甄蓉蓉等人的研究表明，地黄益智方可能通过调控Nrf2/ARE 信号通路抑制APP/PS1 双转基因小鼠海马神经元凋亡[31]。王珊等人的研究表明，Nrf2/HO-1 通路下调参与了Aβ 诱导的氧化应激损伤，丹皮酚可以通过激活该通路对AD起到神经保护作用[32]。我们的研究表明，3×Tg-AD 组小鼠脑组织中Nrf2 表达水平降低，而Keap1 的表达水平升高，说明3×Tg-AD 组小鼠脑部氧化/还原平衡被打破。3×Tg-AD+QT组小鼠脑组织中Nrf2表达增多，与之对应的是Keap1表达下降。

我们的研究结果表明，QT 可以降低9 月龄3×Tg-AD 小鼠血清中 MDA 水平，升高 SOD 和 GSH-Px 水平；抑制炎症因子NO、TNF-α、IL-1β 的产生；上调Nrf2 的表达，降低Keap1的表达。但是QT如何通过氧化应激途径改善3×Tg-AD 小鼠的认知功能障碍，还需要进一步的探讨。综上，我们的研究采用3×Tg-AD 小鼠作为槲皮素防治AD 的动物评价模型，初步探讨了槲皮素在AD 中的作用与可能的机制。槲皮素可能通过调节Nrf2/Keap1 通路，改善氧化/还原失衡的状态，抑制脑内炎症反应从而改善3×Tg-AD小鼠的认知功能障碍。

本工作的主要创新点主要有以下两点，首先动物模型选择了3×Tg-AD 小鼠，3×Tg-AD 小鼠是一种理想的探索AD 的动物模型，其具有3 个突变等位基因，纯合子可存活并具有生育能力，无明显天生缺陷或异常行为。其次探讨了槲皮素在3×Tg-AD 小鼠中对氧化应激水平和氧化应激相关通路的影响，为将槲皮素开发成为防治AD的药物的提供新的证据。