连二亚硫酸钠诱导SY5Y细胞缺糖缺氧模型及泽泻白术药对的作用观察＊

刘莉娜，王红梅，周建明，孟兆青，许治良，周 军，王振中，萧 伟

（1.江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2.中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

连二亚硫酸钠诱导SY5Y细胞缺糖缺氧模型及泽泻白术药对的作用观察＊

刘莉娜，王红梅，周建明，孟兆青，许治良，周 军，王振中，萧 伟＊＊

（1.江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2.中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

目的：建立连二亚硫酸钠（Na2S2O4）诱导SH-SY5Y神经细胞缺氧缺糖损伤模型，进行提取物筛选，对筛选出的有活性提取物初步探讨其对神经细胞的保护作用。方法：CCK-8检测细胞存活率，比色法检测乳酸脱氢酶（LDH）释放，超氧化歧化酶活性（SOD），丙二醛含量（MDA），荧光探针负载法检测细胞内活性氧（ROS）和细胞内钙离子（[Ca2+]i）荧光强度。结果：连二亚硫酸钠诱导SH-SY5Y细胞损伤模型上进行提取物初筛，发现泽泻白术药对提取物有一定活性。与模型组比较，提取物组细胞的LDH释放降低，SOD活性升高，MDA含量降低，细胞内ROS水平和[Ca2+]i荧光强度均减弱。结论：泽泻白术药对提取物对连二亚硫酸钠致SH-SY5Y神经细胞损伤有一定的脑保护作用。

SH-SY5Y细胞 缺氧缺糖 脑保护

根据WTO统计，全球脑血管疾病已成为当代第二大致死率的疾病。目前，对缺血引起的脑损伤，尚无有效治疗药物。因此，世界各国都在寻找有效的脑血管保护药物。现有研究表明，多种病理过程参与了脑缺血后的组织损伤，包括自由基、钙超载、兴奋性氨基酸、缺血半暗带代谢障碍、细胞凋亡、炎症以及新型的神经营养和组胺受体激动剂等[1]。国内学者研究发现，多种中药提取物及中药复方制剂表现出抗脑缺血作用的机制主要涉及上述几个方面[2]。

目前在抗脑缺血化合物筛选研究中，虽然整体动物病理模型较接近脑缺血疾病状态，但由于动物的个体差异较大，动物模型的制备有一定难度，对于大量化合物的筛选来说成本高、效率低，而利用离体细胞损伤模型则在一定程度上克服了这些缺点[3]。连二亚硫酸钠诱导SH-SY5Y神经细胞损伤模型比较常见，是国内各大药物筛选中心的常用模型[4]。本研究在此基础上优化了该模型，通过筛选得到有活性的细胞提取物，并对其进行了表征。

1 材料

1.1 仪器与设备

SW-CJ-2F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），Thermo 3100二氧化碳培养箱（美国Thermo公司），CKX41SF倒置显微镜（日本OLYPUS公司），96孔细胞培养板（美国Costar公司），75 cm2细胞培养瓶（美国Costar公司），Infinite M200 PRO酶标仪（瑞士Tacan公司），移液枪（德国eppendorf公司），BXM-30R立式压力蒸气灭菌锅，LD4-2A离心机（北京众益中和生物技术有限公司），c1028细胞自动计数仪（美国Invitrogen公司），ArrayScan高内涵检测仪（美国Thermo公司）。

1.2 试剂

RPMI-1640培养基、无糖RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司，批号分别为：8113041、124813、608759），胰蛋白酶（北京博奥拓达科技有限公司，批号：BH01018），尼莫地平（中国药品生物制品检定所，批号：00270-200002），DMSO（美国Sigma公司，批号：RNBC6511），连二亚硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司，批号：T20101206），CCK-8细胞毒性检测试剂盒（上海贝博生物有限公司，批号：BB130041），乳酸脱氢酶检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：C0016），脂质氧化检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：S0131），总SOD活性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：S0101），Hoechst33258（美国Sigma公司，批号：MKBC2653V），DCFH-DA（美国Sigma公司，批号：122M400V），Fluo-3/AM荧光探针（美国Sigma公司，批号：BCBG8147V）；SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞株购于中国科学院典型培养物保藏中心上海细胞库。

2 方法

2.1 样品的制备

泽泻Alismatis Rhizoma，白术Atractylodis Macrocephalae Rhizoma经江苏康缘药业股份有限公司高级工程师王振中鉴定符合中国药典规定。

称取药材共300 g，置于5 L烧瓶中，加入10倍量饮用水浸泡1 h后，加热回流2 h，药渣中加入8倍量的饮用水，加热回流1 h，合并两次提取液，过滤后上HP20型大孔树脂（500 mL树脂），上样流速1 BV·h-1。用4 BV纯水冲洗柱子，洗脱流速1.5 BV·h-1，再依次用20%、40%、95%乙醇洗脱（各4 BV，流速1.5 BV），收集各段洗脱液，分别于70℃下减压浓缩至小体积，冷冻干燥既得样品，每个部位得率基本在1%左右。

精确称取样品溶于DMSO中，使其终浓度为50 mg·mL-1。

2.2 细胞培养与给药

细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，吸弃上清，按照实验要求分为空白组、模型组、阳性药组、提取物组。空白组给予完全培养基100 μL，其余各组给予100 μL含终浓度为4 mmol·L-1的连二亚硫酸钠的无血清无糖培养基100 μL。缺氧缺糖一定时间，PBS清洗细胞孔一次，空白组和模型组给予完全培养基100 μL，给药组给予完全培养基配制的终浓度为20 μmol·L-1的尼莫地平溶液和中药提取物溶液100 μL。复氧一定时间后，进行细胞活性、乳酸脱氢酶（LDH）释放，脂质氧化（MDA）、总SOD活性、活性氧（ROS）和细胞内钙离子（[Ca2+]i）荧光强度测定。

2.3 测定CCK-8

各孔加入CCK-8溶液10 μL，同时设置空白孔（培养基和CCK-8，无细胞）和对照孔（不加培养基和CCK-8，有细胞）。37℃孵育4 h后，酶标仪在450 nm下测定吸光度。

2.4 测定LDH释放量

各孔液体体积增加到200 μL。每组设三个复孔。复氧3 h后，将细胞培养板400 g离心5 min，分别取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相应孔中。各孔分别加入60 μL乳酸脱氢酶（LDH）溶液，混匀，室温避光孵育30 min，490 nm处测定吸光度。

2.5 测定脂质氧化情况（MDA）

细胞培养和给药在24孔板中进行，每组设三个复孔。弃上清，PBS清洗一次，细胞裂解液处理细胞，裂解后，1 600 g离心10 min取上清。设置检测反应体系，混匀，100℃加热15 min，冷却后1 000 g离心10 min，取200 μL上清加入96孔板中，酶标仪在532 nm处测定吸光度。

2.6 测定总SOD活性

细胞培养和给药在24孔板中进行，每组设三个复孔。弃上清，PBS清洗一次，细胞裂解液处理细胞，裂解后，1 600 g离心10 min取上清。按照说明书进行样品测定，37℃孵育20 min，在450 nm下测定吸光度。

2.7 测定细胞内活性氧（ROS）

PBS清洗细胞孔一次，各孔加入含DCFHDA荧光探针（10 nmol·L-1）和Hoechst 33258（2 μmol·L-1）的PBS液100 μL，37℃暗处孵育20 min后，高内涵检测仪通道1、通道2进行荧光检测。

2.8 测定细胞内钙离子（[Ca2+]i）

弃去上清，每孔加入含Fluo-3/AM（5 μmol·L-1）的BSS液100 μL，37℃暗处孵育40 min。弃上清，HBSS-BSA液清洗细胞孔一次，每孔加入含Hoechst33258（2 μmol·L-1）的BSS-BSA液100 μL，暗处孵育30 min后，高内涵检测仪通道1、通道2进行荧光检测。

3 结果

3.1 筛选模型的建立与优化

3.1.1 缺氧复氧时间

细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，模型组加入5 mmol·L-1连二亚硫酸钠分别损伤1、2、3、3、4 h，弃上清，PBS清洗细胞孔一次，加入完全培养基相应复氧3、2、1、2、1 h后进行活力检测，发现细胞在缺氧1 h、复氧3 h后损伤较大，故选择此时间点。见图1B。

3.1.2 缺氧剂浓度

细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，分别加入0、1、2、4、8、12 mmol·L-1的连二亚硫酸钠进行损伤1 h，弃上清，PBS清洗细胞孔一次，加入完全培养3 h后进行活力检测。当浓度为2 mmol·L-1时，模型组有细胞固缩成圆形，其存活率和空白对照组已经有显著性差异，为了不使细胞损伤过度，选择4 mmol·L-1浓度进行缺氧损伤。见图1A。

3.1.3 细胞密度

细胞以3×104个/mL、5×104个/mL、10×104个/mL、15×104个/mL、20×104个/mL密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，模型组加入4 mmol·L-1连二亚硫酸钠损伤1 h后弃上清，PBS清洗细胞孔一次，加入完全培养基3 h后测定细胞活力。细胞接种密度为10×104个/mL时，细胞损伤显著，故选择此浓度。见图1C。

3.1.4 药物孵育时间

图1 筛选模型的优化

细胞以1×105个/mL密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，模型组和阳性药组加入4 mmol·L-1连二亚硫酸钠损伤1 h，弃上清，PBS清洗细胞孔一次，空白组和模型组给予完全培养基100 μL，阳性药组给予完全培养基配制的终浓度为20 μmol·L-1的尼莫地平溶液100 μL，复氧0.5、1、2、3、4 h后测定细胞活力。结果显示，尼莫地平复氧孵育3 h时能显著提高细胞存活率。见图1D。

3.2 筛选方法的评估

Z′因子法是评估高通量筛选模型的重要方法，为检测该模型是否适合高通量筛选要求，本研究对筛选模型的Z′因子进行了测定：随机选取96孔板的60个孔，其中30个孔为阴性对照（细胞不加缺氧剂），30个孔造模，4 h后检测细胞活力。利用公式一下计算：

其中，μ+为空白对照组平均值，μ-为模型组平均值，σ+为空白组标准偏差，σ-为模型组平均值。通过计算可知，Z′=0.76，CV为4.8%和7.2%，这说明该模型稳定。

随机选取96孔板的60个孔进行缺氧损伤1 h，弃上清，PBS清洗细胞孔一次，其中30个孔加入20 μmol·L-1的尼莫地平溶液，30个孔加入完全培养基作为阴性对照，4 h后检测细胞活力。利用上述公式计算，其中μ+为阳性药组平均值，μ-为模型组平均值，σ+为阳性药组标准偏差，σ-为模型组平均值，得到结果为Z′=0.79，CV为3.7%和4.6%，这说明该筛选模型适合高通量药物筛选的要求。

3.3 药物筛选

进行药物筛选时，用含9%FBS的RPMI-1640培养基（缺氧时用不含血清的无糖RPMI-1640培养基），细胞以1×105个/mL密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h，空白组加入完全培养基，其余各组加入4 mmol·L-1连二亚硫酸钠损伤1 h，弃上清，PBS清洗细胞孔一次，空白组和模型组给予完全培养基100 μL，给药组给予完全培养基配制的终浓度为20 μmol·L-1的尼莫地平和中药提取物（DMSO浓度为1‰）100 μL，复氧3 h后测定细胞活力，每组设3个复孔。如果样品的平均活性＞M+3SD，则可认为可能是有活性的。

利用优化后的方法提取物进行药物筛选，发现了一些提取物有活性。

3.4 筛中物活性的进一步表征

为了进一步验证筛中物的活性，本研究对泽泻白术药对提取物进行了活性表征，结果发现：泽泻白术药对提取物具有很好的抗连二亚硫酸钠诱导缺氧缺糖的SH-SY5Y细胞损伤的活性。

3.4.1 抑制乳酸脱氢酶的释放

连二亚硫酸钠诱导缺氧缺糖的SH-SY5Y细胞，乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）释放显著增加，泽泻白术药对提取物能明显抑制乳酸脱氢酶释放，这说明该提取物能对连二亚硫酸钠诱导缺氧缺糖损伤的SH-SY5Y细胞有良好的保护作用。见图2。

3.4.2 抗氧化作用

连二亚硫酸钠诱导缺氧缺糖的SH-SY5Y细胞，SOD活性显著降低，MDA含量明显增加，ROS水平显著提高，泽泻与白术药对提取物能明显降低MDA含量和ROS水平，提高SOD活性，这说明该提取物能对连二亚硫酸钠诱导缺氧缺糖损伤的SH-SY5Y细胞有抗氧化作用。见图3。

3.4.3 细胞内钙离子的检测

连二亚硫酸钠诱导缺氧缺糖的SH-SY5Y细胞，细胞内钙离子显著增多，泽泻与白术药对提取物能明显降低细胞内[Ca2+]i水平。见图4。

图2 泽泻白术药对提取物对细胞的LDH释放量影响

图3 泽泻白术药对提取物对细胞的抗氧化影响

4 讨论

根据发病原因的不同，脑血管疾病可分为缺血性和出血性病变，前者具有发病率高、致残率高和复发率高的特点。因此，对缺血性脑血管病的防治倍受社会关注，同时通过建立体外细胞损伤模型对组分进行活性筛选也成为研究热点。本研究通过模型优化建立了细胞损伤模型，同时测定Z′因子大于0.5，由此证明此模型比较稳定，可以用来进行药物筛选。

图4 泽泻白术药对提取物对细胞内[Ca2+]i影响

高内涵筛选技术在药物研发的初筛、机制研究和安全性评价方面具有重要作用，能将药物对活细胞的作用进行图像采集，通过软件进行数据分析得到实验结果[5]。本研究尝试用不同的荧光探针对细胞进行染色，获得相关数据[6、7]。实验发现，细胞损伤过程中部分死亡，细胞数目减少，模型组总体荧光值较小；空白对照组细胞数目较多得到的总体荧光值较高，直接用酶标仪测定荧光强度不能正确反映ROS和钙离子的水平。因此，本研究选择高内涵仪器用Hoechst标记细胞核，通过数据输出系统得到平均荧光值来考察提取物对细胞的相关影响[8]。

氧化应激可引起细胞死亡，活性氧作为第二信使在许多信号通路中扮演着重要角色，比如AKT途径、线粒体介导的caspase凋亡途径等[9]。SOD能清除自由基，MDA水平变化可以间接反映体内自由基的生成，三者能作为抗 氧化的指标。

钙离子超载是引起脑缺血的一大因素。细胞缺氧缺糖时，由于细胞线粒体功能障碍，细胞内[Ca2+]i水平明显提高[10]。实验中可以看到[Ca2+]i水平随ROS水平的增加而增加，也有相关报道显示两者相互促进，影响细胞凋亡[11]。

中药药对是指中医临床相对固定的两味药组成的方剂，是中药复方配伍中比较常见的形式。药对配伍组合研究有助于剖析方剂配伍机理及其治疗疾病的作用机制[12]。泽泻白术药对中的“泽泻”可用于治疗水肿胀满、高血脂症[13]。有报道称泽泻提取物是毒蕈胆碱M1受体激动剂，具有脑保护作用[14]。白术中的白术多糖能显著地抑制缺氧复氧诱导的神经细胞早期凋亡[15]。

本研究发现连二亚硫酸钠诱导SH-SY5Y细胞损伤后，泽泻白术药对提取物对该损伤细胞有一定的保护作用，这可能与其抗氧化应激作用和改善钙离子超载有关，泽泻白术提取物中发挥作用的物质基础，还有待进一步研究。

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Drug Screening against Damage of Na2S2O4induced SH-SY5Y Cells by Oxygen-glucose Deprivation and Effect of Herb Pair of Zexie-Baizhu

Liu Lina, Wang Hongmei, Zhou Jianming, Meng Zhaoqing, Xu Zhiliang, Zhou Jun, Wang Zhenzhong, Xiao Wei
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical, Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001 China)

This study was aimed to establish the Na2S2O4induced SH-SY5Y cell in order to screen model for the research of effective extractions of herb pairs and its related mechanism. CCK-8 was used to detect cell survival rate. Colorimetric method was used to detect the releasing of lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA). Fluorescence probe method was used to detect the fluorescence intensity of reactive oxygen species (ROS) and intracellular calcium concentration ([Ca2+]i). The results showed that the extract screened with Na2S2O4induced SH-SY5Y cell indicated that herb pair ofZexie-Baizhuhad certain activity on the extract. Compared to the model group, the releasing of LDH decreased, SOD activity increased, the content of MDA decreased, and the fluorescence intensity of ROS and [Ca2+]i decreased in the extract group. It was concluded that herb pair ofZexie-Baizhuhad certain cerebral protective effects on Na2S2O4induced SHSY5Y cell.

SH-SY5Y cell, oxygen-glucose deprivation, cerebral protection

10.11842/wst.2016.03.021

R285.5

A

（责任编辑：马雅静 张志华，责任译审：王 晶）

2014-12-31

修回日期：2015-02-27

＊ 科学技术部国家科技重大专项“重大新药创制”项目（2013ZX09402203）：现代中药创新集群与数字制药技术平台，负责人：王振中。

＊＊ 通讯作者：萧伟，本刊编委，博士，研究员级高级工程师，主要研究方向：中药新药的研究与开发。