超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒在大鼠C6胶质瘤模型中的磁共振强化特征

彭诗博，韩俊源，姚立，李颖，马林*

1.解放军医学院，北京 100853；2.解放军总医院第一医学中心放射诊断科，北京 100853；3.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，北京 100850；4.中国科学院化学研究所，北京 100190；*通信作者 马林 cjr.malin@vip.163.com

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤[1-2]，MRI在胶质瘤诊断中发挥重要作用[3]，通过使用对比剂进行T1WI增强扫描可以提高肿瘤诊断的特异性[4-5]。MR对比剂包括T1对比剂和T2对比剂[4,6]，既往研究中氧化铁纳米颗粒的粒径较大，作为T2对比剂[7]用于肝脏疾病的增强扫描，随着纳米技术的发展，调控氧化铁纳米颗粒的大小和表面结构可以改变其弛豫性能[8-9]，当粒径较小时，可以作为T1对比剂使用[10-12]，在超高场强下具有优于钆基对比剂的血管成像能力，并具有较大的表面积和良好的表面结构，易于修饰或装载靶向分子、荧光染料、放射性同位素和药物，使纳米颗粒具有早期诊断、多模态成像、靶向治疗的应用前景。目前国际上关于超小超顺磁性氧化铁（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）纳米颗粒作为T1对比剂的研究尚局限在血管成像方向，或仅通过连接特异性探针后对单一肿瘤进行成像使用。本实验使用的新型USPIO纳米颗粒，在未连接探针的情况下即具备成为广谱T1对比剂的潜力，该对比剂具有较好的血管成像能力。本实验采用大鼠C6胶质瘤模型，通过比较给药后肿瘤组织强化率、正常组织与肿瘤组织的对比噪声比（contrast noise ratio，CNR），探讨其用于胶质瘤T1WI增强扫描的可行性，并制订合适的注射方案。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立 雄性SD大鼠25只（斯贝福北京生物技术有限公司），体重250～300 g，SPF级。C6胶质瘤细胞株（武汉普诺赛生命科技有限公司）培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中，传代、消化、离心后配制成浓度为1×105/μl的细胞悬液。大鼠麻醉后取俯卧位，用脑立体定位仪固定大鼠头部，皮肤消毒后纵行切口，分离皮肤软组织，充分暴露颅骨。将钻孔靶点定位于冠状缝后1 mm、矢状缝右侧3 mm处，用牙科钻在颅骨的靶点处钻孔。微量注射器吸取C6胶质瘤细胞悬液10 μl，经骨孔缓慢垂直进针至硬膜下约6 mm，回退1 mm，注射速度为1 μl/min，注射完成后留针10 min，垂直缓慢退针，无菌骨蜡封闭骨孔，缝合伤口，单笼饲养。

1.2 试剂和配液 本研究使用的新型USPIO纳米颗粒由苏州大学研发，通过高温热分解方法制备，最终产品为棕色澄清水溶液，含铁浓度为10 mg/ml，粒径<5 nm，经实验室检验具有加速质子的纵向弛豫能力。该试剂通过军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所的安全性测评。本实验采用5%葡萄糖溶液稀释试剂，配制成浓度为1 mg/ml和5 mg/ml的USPIO纳米颗粒溶液。

1.3 分组及实验方案 将25只大鼠C6胶质瘤模型随机分为5组，每组5只，每组经大鼠尾静脉注射不同浓度和体积的USPIO纳米颗粒，依次为1组（5 mg/ml、5 ml/kg）、2组（10 mg/ml、0.5 ml/kg）、3组（10 mg/ml、5 ml/kg）、4组（10 mg/ml、10 ml/kg）、5组（1 mg/ml、5 ml/kg）。1组给药后1、5、15、30、45、60 min进行T1WI增强扫描，观察不同时间点肿瘤组织强化规律，确定最佳扫描时间，比较该扫描时间下不同体积组（2、3、4组）和不同浓度组（1、3、5组）的强化率和CNR。

1.4 MRI检查 大鼠接种C6胶质瘤细胞后第13天接受MRI检查，采用GE Discovery MR750 3.0T MR扫描仪，选用八通道腕线圈，大鼠麻醉后俯卧固定，尾先进。给药前，采集大鼠颅脑轴位T2WI快速自旋回波序列：TR 3 060.0 ms，TE 109.8 ms，视野4 cm，矩阵224×192，层厚2 mm，层间距0.2 mm，激励次数6；轴位T1WI：TR 727.0 ms，TE 12.1 ms，视野4 cm，矩阵224×192，层厚2 mm，层间距0.2 mm，激励次数4。平扫结束后，经鼠尾静脉留置针快速推注相应浓度和体积的USPIO纳米颗粒，随后在指定时间进行T1WI增强扫描，扫描参数同前。

1.5 病理学检查 大鼠结束MRI后，使用多聚甲醛溶液进行心脏灌流术，取出全脑放置于多聚甲醛溶液中固定。将标本修块、脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色，观察成瘤情况。

1.6 图像分析 由2名具有3年以上放射科工作经验的副主任医师采用盲法测量大鼠注射USPIO纳米颗粒前后的T1图像。感兴趣区选定在同一层面肿瘤的实体部分（避开坏死、囊变、血管）、对侧正常脑组织和背景噪声处，面积设定为5 mm2，每个层面重复测量3次，取平均值。计算强化率：强化率=（SI1－SI0）/SI0×100%，其中SI0、SI1分别为增强前后的肿瘤T1信号值。计算肿瘤组织和正常脑组织CNR：CNR=SNRa－SNRb=（SIa－SIb）/SD，其中SNRa、SNRb分别为肿瘤、正常脑组织的信噪比，SIa、SIb分别为同一层面肿瘤、正常脑组织的T1信号值，SD为背景噪声的标准差。

1.7 统计学方法 采用SPSS 26.0软件，符合正态分布的计量资料以±s表示，1组不同时间点的肿瘤组织强化率和CNR比较采用重复测量资料方差分析，不同时间点两两比较采用SNK法。不同体积组（2、3、4组）、不同浓度组（1、3、5组）的强化率和CNR采用单向方差分析和多个样本均数两两比较（SNK法），P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理结果 本实验中25只大鼠脑内均有肿瘤生长。HE染色后观察可见肿瘤细胞密集，排列紊乱，生长活跃，病理性核分裂象多见。新生毛细血管丰富，血管壁仅一层内皮细胞，缺乏平滑肌，基膜不连续。部分肿瘤组织中心可见坏死区。

2.2 不同时间点肿瘤组织强化规律 平扫示大鼠脑胶质瘤边界不清晰，T1WI呈等或稍低信号。1组大鼠注射浓度为5 mg/ml、体积为5 ml/kg的USPIO纳米颗粒后，分别在1、5、15、30、45、60 min行T1WI增强扫描，肿瘤组织在T1WI上信号逐渐升高，正常脑组织及坏死区信号未见明显改变。肿瘤组织强化率从给药后1 min开始升高，在45 min时达到峰值，经检验时间因素对强化率的变化有影响（F=19.33，P<0.05），同时30～60 min强化率差异无统计学意义（P>0.05）。正常组织与肿瘤组织的CNR从给药后1 min开始升高，在30 min时达到峰值，随后开始降低，经检验时间因素对CNR的变化有影响（F=9.30，P<0.05），注射前与注射后的每个时间点CNR差异均有统计学意义（P<0.05），见图1、2。

图1 大鼠经静脉注射USPIO纳米颗粒前后强化率（A）和CNR（B）随时间的变化

图2 大鼠静脉注射USPIO纳米颗粒前（A）及注射后1 min（B）、5 min（C）、15 min（D）、30 min（E）、45 min（F）、60 min（G）T1WI图像。胶质瘤组织HE染色镜下表现（×400，H）

2.3 不同给药体积的肿瘤组织MR强化特征 3组大鼠平扫后分别注射相同浓度（10 mg/ml）、不同体积（0.5、5、10 ml/kg）的USPIO纳米颗粒，注射对比剂后30 min进行T1WI增强扫描。0.5、5、10 ml/kg组的强化率分别为11.8%、26.9%、11.8%，3组间强化率差异有统计学意义（F=13.14，P<0.05），5 ml/kg组强化率显著优于0.5 ml/kg组和10 ml/kg组（P<0.05），0.5 ml/kg组和10 ml/kg组的强化率差异无统计学意义（P>0.05）。0.5 ml/kg组、5 ml/kg组、10 ml/kg组的CNR差异有统计学意义（F=5.96，P<0.05），5 ml/kg组的CNR优于0.5 ml/kg组（P<0.05），5 ml/kg组和10 ml/kg组的CNR差异无统计学意义（P>0.05），见图3、表1。

表1 不同体积USPIO纳米颗粒增强后的强化率和CNR比较（±s）

表1 不同体积USPIO纳米颗粒增强后的强化率和CNR比较（±s）

注：a与0.5 ml/kg组比较，P<0.05；b与5 ml/kg组比较，P<0.05

项目给药体积0.5 ml/kg 5 ml/kg 10 ml/kg强化率（%） 11.8±3.7 26.9±6.0a 11.8±6.0b CNR 1.549±1.208 4.453±1.819a 2.752±0.780

图3 大鼠静脉注射不同体积USPIO纳米颗粒前后T1WI图像。A、B、C分别为D、E、F给药前的平扫图像，D～F分别为给药体积0.5 ml/kg、5 ml/kg、10 ml/kg

2.4 不同给药浓度的肿瘤组织MR强化特征 3组大鼠平扫后分别注射相同体积（5 ml/kg）、不同浓度（1、5、10 mg/ml）的USPIO纳米颗粒，注射对比剂后30 min进行T1WI增强扫描。1、5、10 mg/ml组的强化率分别为13.7%、26.4%、26.9%，3组间强化率差异有统计学意义（F=10.77，P<0.05），5 mg/ml组和10 mg/ml组的强化率均优于1 mg/ml组（P<0.05），5 mg/ml和10 mg/ml组的强化率差异无统计学意义（P>0.05）。1、5、10 mg/ml组的CNR差异有统计学意义（F=6.73，P<0.05），5 mg/ml和10 mg/ml组的CNR均优于1 mg/ml组（P<0.05），5 mg/ml和10 mg/ml组的CNR差异无统计学意义（P>0.05），见表2、图4。

图4 大鼠静脉注射不同浓度USPIO纳米颗粒前后T1WI图像。A、B、C分别为D、E、F给药前的平扫图像，D～F分别为给药浓度1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml

表2 不同浓度USPIO纳米颗粒增强后的强化率和CNR比较（±s）

表2 不同浓度USPIO纳米颗粒增强后的强化率和CNR比较（±s）

注：a与1 mg/ml组比较，P<0.05

项目给药浓度1 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml强化率（%） 13.7±2.8 26.4±5.8a 26.9±6.0 a CNR 1.833±1.052 6.185±2.506 a 4.453±1.819 a

3 讨论

胶质瘤发病率高、治疗复杂、预后较差，对人类健康构成极大威胁[2]。在MR扫描中通过使用对比剂，可以增加肿瘤组织信号，使之与正常组织形成对比，有利于诊断胶质瘤。本研究中大鼠C6胶质瘤模型注射USPIO纳米颗粒前后行MR扫描，通过观察图像，并计算肿瘤组织T1强化率、正常组织与肿瘤组织的CNR，量化该对比剂对胶质瘤的强化效果。

正常脑组织在血-脑屏障的作用下不产生强化效果，但肿瘤组织强化明显。有研究指出肿瘤细胞的生长与血管生成互相促进，肿瘤组织通过释放血管内皮生长因子[13]，调控内皮细胞上囊泡状细胞器的数量[14]，影响血管的通透性，进而破坏局部血-脑屏障[15]。新型USPIO纳米颗粒通过血液循环至颅内血管，本研究中病理学结果可见肿瘤中新生血管的管壁较薄，基膜不连续，USPIO纳米颗粒的粒径较小，可由此处渗出，积聚在细胞外间隙，与既往研究结果一致，这种由肿瘤血管渗漏介导的高通透性和滞留性效应[16]是MR对比剂在肿瘤部位成像的主要原理。在高通透性和滞留性效应的影响下，USPIO纳米颗粒被动靶向肿瘤组织，在作为对比剂成像的同时，还为搭载纳米药物被动靶向输送至中枢神经系统的肿瘤组织提供了可能。

本研究采集给药后1、5、15、30、45、60 min T1WI增强扫描图像，强化率和CNR从给药后1 min开始快速升高，统计结果显示给药后30～60 min内进行增强扫描可以使肿瘤与正常组织之间产生较好的对比。不同体积组结果显示，5 ml/kg组的肿瘤强化效果优于0.5 ml/kg组，但增加给药体积到10 ml/kg时，图像出现较重伪影，解剖结构显示不清，强化率明显降低。不同浓度组结果显示，1 mg/ml组的肿瘤强化效果不明显，当给药浓度升高至5 mg/ml和10 mg/ml时，肿瘤均出现明显强化，但这两组的强化率和CNR均值无明显差异，表明肿瘤的强化效果并未随着注射体积和浓度的增加而持续增加，推测是因为注射浓度过高时会出现磁敏感伪影，降低图像质量，反而不利于诊断。近年研究表明USPIO纳米颗粒具有较好的血管成像能力[17]，在超高场强（≥7T）下能够清晰地观察到直径为100 μm的血管[18]，但需要构建探针才能够用于肿瘤成像。本研究中新型USPIO纳米颗粒能够作为广谱T1对比剂，兼备肿瘤成像能力和超高场强磁共振血管成像能力。此外，USPIO纳米颗粒的良好表面结构，使其具备构建探针、搭载药物等能力[19-21]，在肿瘤的早期诊断[22]和靶向治疗方面具有广泛的应用前景[23-26]。

本研究的局限性：首先，设置的给药体积和浓度区间较大，后续实验可以设置更多分组，进一步探究最佳注射方案；其次，个别组的强化率与CNR的变化趋势不一致，可能由于每组大鼠胶质瘤模型数量较少，个体差异所致，需扩大样本量进一步研究；最后，应增加实验动物的种类，并逐步纳入更多的疾病模型。

本研究中大鼠静脉注射体积为5 ml/kg、浓度为5 mg/ml的新型USPIO纳米颗粒后，在30～60 min进行T1WI增强扫描，肿瘤组织信号明显升高，与正常组织之间出现明显信号差异，能够达到满意的强化效果。本研究中新型USPIO纳米颗粒展示出作为广谱T1对比剂的成像能力，有助于推进肿瘤分子影像学的进展，为后续研究超高场强MR对比剂奠定基础。