声动力疗法促脑胶质瘤凋亡的实验研究

戴绍春

胡韶山2HU Shaoshan

李 博1LI Bo

声动力疗法促脑胶质瘤凋亡的实验研究

戴绍春1DAI Shaochun

胡韶山2HU Shaoshan

李 博1LI Bo

目的探讨声动力疗法对荷瘤鼠脑胶质瘤组织的促凋亡作用及其治疗机制。材料与方法 74只Wistar大鼠于右侧尾状核处接种C6胶质瘤细胞，制作颅内胶质瘤模型，行增强MRI筛选荷瘤鼠。依MRI结果分为对照组、血卟啉甲醚组（HMME组）、超声组和声动力组（SDT组），每组16只。声动力参数为1.0MHz、1.0W/cm2、60s超声辐照和5mg/kg血卟啉甲醚。治疗后24h行TUNEL染色检测胶质瘤细胞凋亡率，电镜检测凋亡形态学改变，免疫组化检测蛋白GFAP、S-100、Bcl-2/Bax、Caspase-3、Caspase-9、Fas/Fas-L表达和Cyt c释放，并记录4组大鼠生存期。结果74只Wistar大鼠共68只成瘤，成瘤率为91.89%。与对照组[（3.20±0.72）%]比较，SDT组[（30.60±1.60）%]及超声组[（14.50±0.80）%]凋亡率显著提高（P＜0.05），HMME组[（3.60±0.51）%]无明显凋亡发生（P＞0.05）；SDT组荷瘤鼠生存期长达（46.3±3.1）d，较对照组 [（31.1±2.1）d]显著延长（P＜0.05），超声组 [（32.4±2.3）d]、HMME 组[（30.1±3.0）d]生存期较对照组无明显变化（P＞0.05）。电镜检测到SDT组、超声组胶质瘤细胞核固缩，染色质边集，线粒体肿胀；免疫组化显示GFAP、S-100、Bax、Caspase-3、Caspase-9呈高表达，Bcl-2、Fas-L呈低表达和Cyt c释放，Fas表达无明显变化。结论声动力疗法对荷瘤鼠胶质瘤有促凋亡治疗作用，并与线粒体内源性凋亡途径密切相关。

神经胶质瘤；超声疗法；声动力疗法；细胞凋亡；大鼠

由于脑胶质瘤复发率及死亡率较高，其治疗是当今神经外科的一大难题。声动力疗法（sonodynamic therapy, SDT）是近年来兴起的抗肿瘤治疗方法[1]，用于脑胶质瘤的治疗取得了一定成果[2]，但多数研究局限于体外细胞水平，用于动物实验研究少见报道。本实验拟采用胶质瘤原位荷瘤鼠动物模型，采用一定参数的超声波结合血卟啉甲醚（hematoporphyrin monomethyl ether,HMME）进行治疗，以检测凋亡的发生，探讨治疗效果及作用机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

1.1.1 仪器 IX-70相差倒置显微镜（日本Olympus公司），赛福瑞多功能超生治疗仪（Selfridges，北京赛福瑞德公司），磁共振扫描仪（德国Siemens，3.0T）。

1.1.2 试剂 RPMI-1640培养基（Sigma公司），新生小牛血清（杭州四季青公司），免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），TUNEL试剂盒（Roche），DAB显色试剂盒（江苏碧云天公司），血卟啉甲醚（深圳康美公司）。

1.2 实验动物及细胞 74只清洁级雄性Wistar大鼠，体重约200～250g，购自哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心（许可证号：黑动字第80050/011），于25℃、湿度＞40%的饲养室饲养，每天给予饲料及饮用水。C6胶质瘤细胞系由中科院北京生物研究所提供，培养于含10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640完全培养液中，置于37℃、5% CO2饱和湿度孵箱内孵育。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制作 当C6胶质瘤细胞达对数生长期时，调整细胞浓度至5×109/ml以备接种。74只Wistar大鼠用10%水合氯醛麻醉（4ml/kg），固定于立体定向仪上。在前囟后1.0mm、矢状缝右侧3.0mm处，用牙科钻钻一直径1.0mm的小孔，不伤及硬脑膜，将连接于定位仪上的微量注射器的针尖调节至触及硬脑膜，进针6mm，后退1mm，使针尖距硬脑膜5mm。将10 μl细胞悬液缓慢注入脑内，注射时间为10min，留针5min后缓慢退针。用骨蜡封闭骨孔，生理盐水冲洗术野，缝合皮肤，切口消毒，常规分笼饲养。术后每天观察动物生存状态。

1.3.2 增强MRI筛选荷瘤鼠及分组 为确保成瘤率，74只Wistar大鼠于接种后15d腹腔注射钆喷酸葡胺注射液（5mg/kg），行MRI俯卧横断位、冠状位、矢状位扫描及增强扫描。T1WI采用自旋回波（SE）序列；T2WI采用快速自旋回波（FSE）序列。依据MRI成瘤结果，实验完全随机分组，分为对照组、HMME组、超声组、声动力组（SDT组），每组16只。

1.3.3 SDT治疗 超声波参数固定为频率1.0MHz、声强1.0W/cm2、时间60s。每组随机抽取8只荷瘤鼠于接种C6胶质瘤细胞处开窗约2～3mm，超声探头与脑组织之间以生理盐水充填后照射。超声组照射后避光饲养24h；SDT组于超声照射前1h腹腔注射HMME（5mg/kg），照射后避光饲养24h；HMME组单纯给予HMME（5mg/kg）并避光饲养24h。对照组常规饲养24h，不给予治疗。治疗后各组荷瘤鼠行左心室4%多聚甲醛灌注，取完整脑进行检测。

1.4 观察指标 ①观察荷瘤鼠一般状态，包括精神面容、食欲、体重、活动量、有无偏瘫、抽搐等；②增强MRI筛选荷瘤鼠：观察荷瘤鼠胶质瘤组织有无增强，并测量肿瘤的大小；③采用TUNEL试剂盒及电镜，检测声动力治疗后24h各组胶质瘤组织细胞凋亡率；④透射电镜观察声动力治疗后24h各组胶质瘤细胞的超微结构改变；⑤采用免疫组化检测凋亡相关蛋白GFAP、S-100、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达和Cyt c释放；⑥记录荷瘤鼠生存时间：4组大鼠治疗后每组8只继续饲养，直至死亡。记录生存时间及死亡日期，以自然死亡为标准。

1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较行Newman-Keuls检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态 对照组荷瘤鼠接种C6胶质瘤细胞2d后，各组大鼠恢复正常觅食及饮水；4d后大鼠体重开始上升，活动度、兴奋度开始提高，17d左右出现活动度、兴奋度下降等病态表现；超声组和SDT组大鼠于治疗后第10天活动度、兴奋度开始下降；第13天觅食、饮水开始减少，体重下降，皮毛不整，其中6只荷瘤鼠出现偏瘫；HMME组大鼠治疗前后一般状态无明显变化，与对照组表现相同。

2.2 造模结果 增强MRI结果显示，74只大鼠中有68只成瘤，成瘤率为91.89%。

2.3 增强MRI筛选荷瘤鼠 MRI显示肿瘤位于鼠脑右侧基底节区，T1WI呈低信号占位，肿瘤呈圆形或椭圆形，边界清晰，肿瘤直径约（8.0±0.3）mm，增强MRI扫描T1WI显示肿瘤不均匀强化（图1），灶周有水肿带出现、中线无明显偏移。

图1 Wistar大鼠脑胶质瘤MRI增强扫描。A.接种前；B.接种后15d

图2 TUNEL染色检测荷瘤鼠肿瘤组织细胞凋亡情况（×400）。A. 对照组；B. HMME组；C. 超声组；D. SDT组。C、D中可见细胞凋亡，胞质内可见棕色颗粒

2.4 凋亡率 SDT组凋亡率达（30.60±1.60）%，明显高于其他三组（q＝39.9、31.8、18.5,P＜0.05）（图 2）；超声组凋亡率为（14.50±0.80）%，显著高于对照组[（3.2±0.72）%]及 HMME 组 [（3.6±0.51）%]，差异有统计学意义（q＝21.4、20.7,P＜0.05）；HMME组凋亡率与对照组比较，差异无统计学意义（q＝8.12,P＞0.05）。

2.5 凋亡形态学改变 透射电镜观察发现超声组胶质瘤细胞核固缩，核染色质边集，线粒体肿胀和空泡化；SDT组细胞核严重固缩，染色质进一步边集化，大量残留线粒体空泡化，而HMME组和对照组无明显改变（图3）。

图3 电镜下SDT后荷瘤鼠肿瘤细胞的超微结构改变（×10 000）。A. 对照组；B. HMME组；C. 超声组；D. SDT组。A、B中细胞膜及核膜完整，细胞器结构清晰；C、D中胶质瘤细胞核固缩，核染色质边集，线粒体肿胀和空泡化

2.6 GFAP及S-100蛋白表达 4组荷瘤鼠肿瘤组织内均有GFAP、S-100阳性表达，肿瘤细胞胞质内有棕黄色染色（图4），表明经立体定向仪接种C6细胞大鼠脑胶质瘤动物模型的肿瘤标本为胶质源性肿瘤。

图4 荷瘤鼠肿瘤组织中蛋白GFAP和S-100的表达（×400）。A、B分别示GFAP表达细胞及S-100表达细胞胞质内见棕色染色颗粒

2.7 凋亡相关蛋白表达 超声组和SDT组荷瘤鼠肿瘤组织细胞胞质内可见棕黄色颗粒，均有Cyt-c、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达上调，Bcl-2、Fas-L表达下调，但Fas表达无明显变化。SDT组上述蛋白表达更为明显，见图5。

图5 免疫组化半定量分析荷瘤鼠肿瘤组织凋亡蛋白的表达。与对照组及HMME组比较，*P＜0.05

2.8 荷瘤鼠存活时间 SDT组荷瘤鼠生存时间为（46.3±3.1）d，较其他三组明显延长（q=41.2、31.8、18.5,P＜0.05），超声组、HMME组生存期分别为（32.4±2.3）d、（30.1±3.0）d，与对照组 [（31.1±2.1）d]比较无明显延长，差异无统计学意义（q=18.1、17.2,P＞0.05）。

3 讨论

声动力疗法由日本学者梅春晋一郎于1989年提出[1]，通过声敏剂和超声波的协同作用抑制肿瘤生长，此后拓展到胶质瘤的治疗中。血卟啉甲醚是提取自血液的一种有机光敏物质，能与癌细胞蛋白结合或被癌组织中的巨噬细胞吞噬，在肿瘤组织中选择性潴留，同时也可被电磁辐射激活，诱发一系列氧化反应，从而杀伤癌细胞。HMME是第二代声敏剂，还具有光毒反应小、代谢快等优点[3,4]。超声波具有深度聚焦、穿透力强、对周围组织损伤小等优点，适用于不宜切除的脑重要功能区的肿瘤及不能耐受手术患者的治疗。因此，本实验采用HMME和超声波对脑胶质瘤的治疗作用进行在体研究。

MRI增强扫描T1WI序列肿瘤实质明显强化，瘤周可见水肿带。MRI显示大鼠脑肿瘤具备了人脑恶性胶质瘤的影像特征：不规则形状且明显不均匀强化的实体性肿瘤、瘤周围组织水肿[3,4]。肿瘤的强化取决于血-脑屏障的破坏程度，瘤周水肿始于血-脑屏障破坏区，一些血浆和大分子渗透到细胞间隙中，造影剂随之外渗并在肿瘤周围聚集，引起强化并导致瘤周水肿的形成。GFAP和S-100是酸性蛋白，在中枢神经系统主要由胶质细胞，特别是星形胶质细胞合成和分泌，作用于神经元及其生长环境，是胶质细胞与神经元之间相互作用的桥梁，也是星形胶质细胞激活的标志之一[5]。MRI表现及免疫组化GFAP和S-100蛋白表达均表明动物模型肿瘤组织具有胶质原性，与人类脑胶质瘤有高度近似性，适用于SDT的在体研究[4]。

在筛选的声动力条件下，透射电镜观察到SDT组治疗后24h胞核固缩、碎裂及空泡化；TUNEL染色发现胶质瘤细胞胞质内高表达的棕色颗粒，凋亡率达（30.60±1.60）%，表明声动力疗法对动物体内的脑胶质瘤具有明显的促凋亡作用，与细胞水平结果接近[2,6]；同时生存期明显延长为（46.3±3.1）d，治疗作用明显。尽管凋亡率偏低，但细胞的程序性死亡对肿瘤的治疗意义重大[7-10]，为SDT应用于胶质瘤的临床治疗提供实验基础。

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中发挥必要作用。它在生物体进化、内环境稳定以及多个系统的发育中发挥重要作用。细胞凋亡是一个主动过程,它涉及一系列蛋白的激活、表达及调控。SDT对肿瘤的促凋亡机制目前尚无统一结论。许多因素影响SDT的作用机制，如不同的超声波作用参数、不同声敏剂的作用和不同生物组织类型。多数学者认为在SDT过程中产生的活性氧是SDT的主要凋亡机制[11-13]。这种氧化对癌细胞的破坏主要通过破坏癌细胞的脂质和细胞膜，导致膜通透性增强、线粒体膨胀、溶酶体酶释放等损伤、癌细胞内蛋白质变性等最终导致细胞凋亡或坏死[14-16]。细胞凋亡有2个独立的途径：一是外部的死亡受体途径，一是内部的线粒体凋亡途径，这2个途径存在交叉，并在激活Caspase水平进行会聚。细胞凋亡通过Caspase级联而激活。一旦下游的Caspase-3激活，即可启动细胞凋亡，Caspase的激活发生在细胞形态改变前几小时。免疫组化SDT组胞质内出现Bax高表达棕色颗粒和Bcl-2低表达棕色颗粒。Bax/Bcl-2比值升高，说明Bcl-2、Bax参与调节SDT诱导的凋亡；SDT组胶质瘤细胞胞质内Caspase-3、Caspase-9、Cyt c高表达棕色颗粒也说明启动了内源性线粒体途径被启动，线粒体受到损伤，释放凋亡因子，激活Caspase-9、Caspase-3，诱导胶质瘤细胞凋亡。而Fas表达无明显变化，Fas-L在胞质中呈低表达，表明荷瘤鼠胶质瘤组织凋亡与外源性凋亡途径不相关。

综上所述，荷瘤鼠体内研究表明在筛选参数下，SDT能够抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，延长荷瘤鼠生存时间，对胶质瘤具有一定的治疗作用，并与线粒体内源性凋亡途径密切相关，但凋亡率偏低。声敏剂的靶向沉积、贮留时间延长及超声波条件进一步的优化可能提高凋亡率。随着研究的深入，必将推动SDT在临床上早日应用。

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Experimental Study in the Apoptosis of Brain Glioma by Sonodynamic Therapy

PurposeTo investigate the apoptotic effect and mechanisms to C6 glioma cells by sonodynamic therapy (SDT) in vivo.Materials and MethodsSeventy-four tumor-bearing rats were established by inoculating C6 glioma cells into right caudate nucleus of Wistar rats with stereotactic technique and selected by enhanced MRI. The rats were completely randomized and divided into control group, hematoporphyrin monomethyl ether (HMME) group, ultrasound group and SDT group, 16 rats in each group. The parameters of SDT was ultrasound under 1.0 MHz, 1.0 W/cm2, 60s and HMME of 5mg/kg. After 24 hours by SDT treatment or not, apoptotic rate was determined by TUNEL staining, morphological change was observed by the transmission electron microscope (TEM), protein expression of GFAP, S-100, Bcl-2/Bax, Caspase-3, Caspase-9, Fas/Fas-L and cytochrome (Cyt c)were detected by immunohistochemistry. The rats survival time in four groups was also recorded.ResultsThe SDT group showed the highest apoptotic rate of(30.60±1.60)% (P＜0.05), then the ultrasound group of (14.50±0.80)% (P＜0.05),and no signi fi cant apoptosis was observed in the HMME group when compared to the control group. The long survival time of (46.3±3.1) days was presented in the SDT group (P＜0.05), and no obvious change was displayed in survival time in the other three groups. Morphological characteristic changes of apoptosis including nuclear chromatin margination, aggregation and condensation were observed by TEM in SDT group. The expressions of the GFAP, S-100, Caspase-9, Caspase-3, Bax were upregulated and release of Cyt c, Bcl-2 and Fas-L were down-regulated, and Fas was constant in tumor-bearing rats in the SDT group compared to the other three groups.ConclusionSDT has an obviously therapeutic effect to C6 glima cells in ratsin vivo,and is closely associated with the mitochondrial signal apoptosis pathway..

Glioma; Ultrasonic therapy; Sonodynamic therapy; Apoptosis; Rats

10.3969/j.issn.1005-5185.2012.12.013

1. 哈尔滨医科大学附属第三医院超声科黑龙江哈尔滨 150040

2. 哈尔滨医科大学附属第二医院神经外科黑龙江哈尔滨 150001

胡韶山

Department of Neurosurgery, the Second Af fi liated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China

Address Correspondence to：HU ShaoshanE-mail： shaoshanhu@hotmail.com

中国图书资料分类法分类号R739.41

2012-10-31

2012-11-20

中国医学影像学杂志2012年 第20卷 第12期：924-927，931

Chinese Journal of Medical Imaging 2012 Volume 20(12)： 924-927, 931

（责任编辑 张春辉）