基于肿瘤相关巨噬细胞靶向调控的抗肿瘤策略

褚旭新，卜凡雪，殷婷婕，霍美蓉

（中国药科大学药学院药剂系，南京210009）

肿瘤的发展是一个复杂的多步骤过程，包括转化、增殖、血管生成、免疫调节和转移［1］。然而，肿瘤的发生与发展不仅由肿瘤细胞本身积累的遗传突变诱导，还受到周围非恶性细胞的强烈影响［2］。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中细胞释放的不同类型的生长因子和细胞因子以及细胞间的信号通路在肿瘤发生和转移中起十分重要的作用［3］。肿瘤微环境包括许多常驻细胞类型，例如巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞和周细胞等（如图1所示），它们可通过直接或间接的作用影响彼此的功能或表型，并促进肿瘤细胞的生长［4］。

Figure 1 Cellular constituents of thetumor microenvironment[17]

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macro⁃phages，TAMs）是TME中最丰富的固有免疫细胞种群，占肿瘤质量的50%［5-6］。巨噬细胞是单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocytic system，MPS）的一部分，由骨髓来源的外周血单核细胞前体在局部募集并响应趋化因子和生长因子分化形成［7］。巨噬细胞极具可塑性，可以根据环境刺激获得不同的功能表型。按照M1/M2命名法巨噬细胞可被定义为两种极化表型：当受到toll样受体（toll-like receptor，TLR）激动剂、微生物底物［如脂多糖（lipo⁃polysaccharide，LPS）］和辅助型T细胞1（Thelper 1 cell，Th1）因子［如干扰素（interferonγ，IFN-γ）］适当刺激时，经典激活为免疫增强型——M1型，具有引起炎症反应，增强抗肿瘤免疫的能力［8］；在肿瘤部位被各种辅助型T细胞2（Thelper 2 cell，Th2）因子［如白介素-4（IL-4）和白介素-13（IL-13）］刺激时，替代激活为免疫抑制型——M2型，发挥抗炎作用，促进肿瘤生长和转移［9］。

肿瘤微环境以缺氧、弱酸性为主要特征，通常不存在诱导M1型巨噬细胞极化的细菌刺激物、Th1细胞因子及代谢环境，且普遍存在Th2细胞因子，因此TAMs在肿瘤部位多呈现M2表型［10］。M2-TAMs表现出多项促肿瘤作用：（1）抑制肿瘤免疫反应，特别是T细胞介导的细胞毒性［11］；（2）诱导肿瘤血管生成［12］；（3）参与肿瘤迁移，侵袭和转移［13］；（4）增强肿瘤化学疗法和放射疗法的耐药性［14］。综上，作为TME中主要的免疫细胞，TAMs在肿瘤发展和转移的各个阶段均起关键作用［15］。因此靶向调控TAMs的策略成为一种多机制、多功能的高效疗法，可激活抗肿瘤免疫反应、抑制肿瘤生长、血管生成和转移扩散；并改善化疗耐药和不良预后。同时，与化疗等经典疗法相比，TAMs调控策略是通过调节自身免疫系统功能对抗肿瘤，对患者正常组织的损伤较小。鉴于TAMs已成为抗肿瘤治疗的新靶标，临床前研究揭示了越来越多的关键途径以调节TAMs功能。目前，针对TAMs的新型调控策略在肿瘤免疫治疗以及与其他疗法的联合治疗均表现出巨大的潜力［16］。

1 TAMs靶向调控策略

基于TAMs在肿瘤发生发展中的功能，TAMs靶向调控策略包括：TAMs耗竭、抑制TAMs募集和TAMs复极化［18］。

1.1 TAMs耗竭

TAMs调控的策略之一是使用消耗巨噬细胞的化学试剂直接清除TAMs，降低TAMs在肿瘤组织的密度，从而逆转免疫抑制型肿瘤微环境［19］。

集落刺激因子1（colony-stimulating factor 1，CSF1）是大多数巨噬细胞种群的主要调节剂和趋化因子，其受体CSF1R是一种酪氨酸激酶，可促进单核细胞和巨噬细胞的存活、增殖和分化［20］。巨噬细胞对CSF1/CSF1R信号转导的依赖使CSF1R成为选择性耗尽TAMs的靶标。目前，针对CSF1R信号的不同抗体和小分子已被广泛研究。它们单独或联合用于耗竭TAMs，重塑TME，进而发挥抗肿瘤作用［21］。Ries等［22］研制了抑制CSF1R活化的单克隆抗体（RG7155）。体外实验结果表明，RG7155可诱导巨噬细胞凋亡；在动物模型中，RG7155可显著降低F4/80+TAMs的密度，并伴随CD8+/CD4+T细胞比例的增加，改善免疫抑制型肿瘤微环境，激活抗肿瘤免疫；对于肿瘤患者，RG7155可使肿瘤组织中CSF1R+CD163+TAMs显著减少，临床抗肿瘤效果优异。

另一种TAMs消耗策略是基于双膦酸盐（bisphosphonates）的应用。鉴于对羟基磷灰石的高结合亲和力，双膦酸盐一般被用于抑制破骨细胞的功能，抑制骨吸收，从而治疗骨质疏松症、骨转移和骨科Paget's病［23］。而近年来研究发现，双膦酸盐（氯膦酸盐、唑来膦酸盐等）可影响TAMs的增殖并诱导其凋亡，减少新血管生成，最终抑制肿瘤生长和转移［24-25］。但其抗肿瘤活性常常受到血浆半衰期短和脱靶效应的限制［26］。因此，为了改善双膦酸盐的药代动力学，减少不良反应（例如下颌骨坏死），并促成骨骼以外的生物分布以适应非骨骼相关治疗领域的应用，研究者们通常使用双膦酸酯脂质体制剂或纳米颗粒靶向消耗TAMs［27］。如Zang等［28］开发的脂质包覆的唑来膦酸钙纳米粒（CaZol@pMNPs）能特异性靶向TAMs并诱导其凋亡。在S180荷瘤小鼠模型中，CaZol@pMNPs有效地消耗了TAMs，显著减少了血管生成，削弱了免疫抑制作用，并最终抑制了肿瘤的生长。

1.2 抑制TAMs募集

单核细胞/巨噬细胞从血液中募集并渗入肿瘤。因此，通过靶向和影响单核细胞来破坏TAMs的产生，可有效抑制TAMs募集，减少实体瘤中的TAMs浸润，重塑免疫抑制TME［29］。

单核细胞和单核细胞型骨髓来源的抑制性细胞（monocyte-related myeloid-derived suppressor cells，M-MDSCs）是TAMs的前体，在多种化学引诱剂的指导下募集到肿瘤部位。常见的诱导剂包括趋化因子（如CCL2，CCL5）和细胞因子（如VEGF家族成员）［30］。利用小分子抑制剂或特异性抗体阻断相关信号通路是抑制TAMs募集的有效手段。例如，在晚期胰腺癌模型中，肿瘤细胞释放的CC族趋化因子配体2［chemokine（C-C motif）ligand 2，CCL2］募集表达相关受体（CCR2）的经典单核细胞至肿瘤部位，可导致肿瘤组织中TAMs数量积累和不良预后。CCR2抑制剂PF-04136309可有效阻断CCL2-CCR2轴通路，其与FOLFIRINOX（亚叶酸钙+氟尿嘧啶+伊立替康+奥沙利铂）化疗的联合疗法使肿瘤内CCR2+单核细胞数量减少，且较单一化疗表现出更明显的局部肿瘤控制效果［31］。

1.3 TAMs复极化

尽管TAMs主要表现为促肿瘤表型，但巨噬细胞作为重要的吞噬细胞，同时具有抗原提呈能力。在肿瘤发展的不同阶段以及治疗过程中，TAMs具有从肿瘤促进型转换为肿瘤杀伤型的能力，并通过激活免疫反应抑制肿瘤的生长［32］，其复极化过程如图2所示。这表明利用巨噬细胞可塑性诱导TAMs复极化为抗肿瘤表型是一种可行的靶向治疗策略。细胞因子、趋化因子、生长因子与其受体的相互作用可指导TAMs极化程序［33］，因此，借助小分子，抗体和RNA重塑TAMs表型是一种常用的免疫调节策略，可以单独或与其他策略（如经典化疗、免疫检查点抑制剂疗法等）联合用于抗肿瘤治疗。

Figure 2 Illustration of TAMs repolarization[34]

一种手段是通过阻断CD47/SIRPα（“别吃我”）信号，增强TAMs的吞噬特性，恢复对肿瘤细胞的清除机制［35］。如抗CD47单克隆抗体（Hu5F9-G4、CC-90002等）或可溶性重组融合蛋白SIRPα-Fc（TTI-621）对该信号通路的药理抑制作用可有效增强TAMs对肿瘤细胞的吞噬能力。此外，此策略与其他抗体（如利妥昔单抗等）联合用于治疗淋巴瘤，可进一步增强肿瘤抑制效果［36］。

Toll样受体（TLR）是一种模式识别受体（pat⁃tern recognition receptor，PRR），在先天免疫应答的激活中具有重要作用。细菌颗粒（如LPS）或病毒核酸（RNA或DNA）对TLR的激活能够诱导免疫反应，使巨噬细胞趋向于促炎的M1表型。不同的TLR激动剂可模拟微生物信号，将TAMs转换为杀伤肿瘤的表型［37］。如TLR3激动剂聚肌胞苷酸［Poly（I∶C）］作为一种抗肿瘤疫苗，可使黑色素瘤中的TAMs重新极化，从而改善晚期癌症的抗肿瘤免疫反应［38］。胶原结构巨噬细胞受体（macro⁃phage receptor with collagenous structure，MARCO）是属于清道夫受体家族的PRR。MARCO主要由巨噬细胞表达，其表达与多种肿瘤的不良预后有关。据报道，针对MARCO受体的抗体可将TAMs再极化至促炎表型，与检查点细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated pro⁃tein 4，CTLA-4）抑制剂联用可提高抗肿瘤免疫应答［39］。

此外，与巨噬细胞表型极化相关的信号通路中的关键激酶也可作为调节的靶点，几种小分子抑制剂通过调节巨噬细胞的重新极化发挥抗肿瘤作 用。例 如，PI-3激 酶γ（PI-3 kinase gamma，PI3Kγ）是介导TAMs免疫抑制作用的关键调节剂，其抑制剂通过诱导M1-TAMs产生炎症反应，阻止肿瘤生长［40］。

另一个有潜力的策略是在表观遗传水平上诱导TAMs复极化。如组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂TMP195能够改变TAMs表观遗传学特征，从而使其趋向于M1行为，诱导它们在乳腺癌TME中积累，并增强其吞噬活性［41］。

除此之外，一些无机纳米粒如氧化铁纳米粒、碳酸钙纳米粒等，可通过调节活性氧、肿瘤微环境的酸度等介导TAM的复极化［42］。

相比于TAMs耗竭和抑制TAMs募集策略，TAMs复极化策略不仅使免疫抑制型TAMs减少，还使促炎表型巨噬细胞增加，更高效地逆转了免疫抑制型TME。同时，该策略避免了巨噬细胞急剧减少对正常组织的影响，不良反应较小。因此，TAMs复极化策略在肿瘤免疫治疗领域受到更广泛的关注。

2 纳米载体靶向TAMs治疗策略

许多针对不同分子靶标的药物具有调节TAMs进而对抗肿瘤的潜力。下一个挑战是如何将这些免疫调节药物有效地、选择性地传递给TAMs，最大限度地降低脱靶问题和药物不良反应。着眼于纳米递药技术的最新进展，纳米材料介导的TAMs靶向策略，可特异性增强抗肿瘤免疫反应，已展现出明显的临床前疗效和潜在的临床意义。目前，靶向TAMs纳米载体的设计主要依赖于肿瘤血管的高通透性和高滞留（enhanced perme⁃ability and retention，EPR）效应以及受体与配体或抗原与抗体间的相互识别作用，分别称为“被动靶向”和“主动靶向”策略［43］，其靶向过程如图3所示。

Figure 3 Current targeting strategies for cancer therapy

2.1 被动靶向至TAMs

作为生物体内清除细胞碎片、病原体和异物的主要细胞，巨噬细胞具有很高的吞噬能力。对于纳米载药系统，巨噬细胞可以不加选择地使其内在化，且通常M2-TAMs比M1-TAMs表现出更高的纳米粒内化效率。另外，TAMs是TME中最丰富的细胞种群，靶向肿瘤部位的纳米粒通过非特异性脱靶效应，可以被TAMs摄取。如双膦酸盐脂质体依赖在肿瘤部位的被动积累，诱导动物体内TAMs的凋亡，是目前耗竭TAMs的主要纳米制剂［45］。

基于EPR效应和巨噬细胞自身的吞噬能力，纳米载药系统可以被动靶向至TAMs，并对其进行特异性调控，从而改善免疫抑制型肿瘤微环境，最终发挥抗肿瘤作用。然而，仍有大部分纳米粒在TME中被肿瘤细胞或其他非恶性细胞内吞，从而降低其在TAMs中的富集水平，削弱了调控效果。因此，基于TAMs高表达的表面受体，设计特异性配体修饰型的纳米载体用于主动靶向TAMs，可有效提高内吞和调控效率［46］。

2.2 巨噬细胞主动靶向策略

2.2.1 甘露糖受体介导的主动靶向 甘露糖受体（CD206）由于在巨噬细胞上过表达而成为最常用的TAMs靶向受体之一［47］。天然配体甘露糖结构简单，可轻松地与载体结合，发挥靶头作用。Zang等［48］报道了基于甘露糖修饰的磷酸钙纳米粒（CaP/miR@pMNPs）用于TAMs靶向治疗。该纳米粒在生理pH（pH 7.4）下被脂质包覆屏蔽，被MPS中的正常巨噬细胞摄取较少；在TME中（约pH 6.8），对弱酸敏感的脂质屏蔽层响应性脱落，并暴露出甘露糖靶头以促进TAMs摄取。该载体用于递送具有促炎作用的miR155，可重塑TAMs并激活其功能，逆转免疫抑制性TME，并在荷瘤小鼠模型中抑制肿瘤生长。然而，由于甘露糖与载体结合率较低，甘露糖受体介导的主动靶向策略依然存在脱靶风险。因此，作为甘露糖的替代物，CD206抗体被用于靶向TAMs，从而提高纳米载体的靶向效率［49］。

2.2.2 叶酸受体β介导的主动靶向 叶酸受体β（folate receptorβ，FRβ）也是巨噬细胞高表达的表面受体，其与叶酸具有纳摩尔级别的高度亲和力。因此，可使用其配体叶酸修饰纳米粒介导TAMs靶向递送［50］。Hattori等［51］评估了载唑来膦酸的叶酸偶联型脂质体（FL-ZOL）的靶向能力，发现FL-ZOL对鼠源巨噬细胞RAW 264.7表现出高细胞毒性，而对FRβ阴性的小鼠结肠腺癌细胞CT26则无毒性，表明FL-ZOL可通过FRβ介导的内吞作用选择性地被TAMs内化。因此，构建叶酸偶联型载药系统是解决TAMs靶向问题的可行思路。

2.2.3 豆荚蛋白和转铁蛋白受体介导的主动靶向 豆荚蛋白（legumain）和转铁蛋白受体（trans⁃ferrin receptor）是在巨噬细胞过表达的另外两个靶标受体，且广泛存在于几种肿瘤细胞类型中［52］。

基于豆荚蛋白对Ala-Ala-Asn底物序列的蛋白水解活性，可设计靶向TAMs前药或智能药物递送系统［53］。Lin等［54］通过将含有上述序列的底物肽偶联在阿霉素上，设计了一种豆荚蛋白激活型的阿霉素前药Leg-3。Leg-3在TME中被选择性激活，从而有效清除TAMs，并导致肿瘤血管的生成显著减少。体内实验证实，施用Leg-3后，鼠肿瘤模型中肿瘤的生长和转移受到明显的抑制。这些结果表明，豆荚蛋白的TAMs靶向可能代表了一种新的抗肿瘤策略。

尽管TAMs高表达的转铁蛋白受体受到广泛关注，且研究者们已经报道了许多靶向转铁蛋白受体的药物递送系统。但所有这些系统都是针对靶向表达该受体的肿瘤细胞而设计的，尚未见对TAMs具体应用的报道［55］。

2.3 M2-TAMs特异性主动靶向策略

甘露糖受体、叶酸受体β以及豆荚蛋白除了在M2-TAMs表面高表达之外，在TME中其他细胞（如树突状细胞、M1-TAMs和肿瘤细胞等）也有表达［56-57］，造成载药纳米递送系统的脱靶效应。因此，研究者们通过肽筛选技术开发了一种特异性靶向M2-TAMs的多肽（M2pep）。该肽对M2-TAMs的结合能力高于M1-TAMs以及其他细胞，可更高效地介导M2-TAMs主动靶向［58］。Pang等［59］设计了M2pep包覆的PLGA纳米粒递送CSF1-CSF1R通路抑制剂（PLX3397）用于治疗B16F10肿瘤。无论在体内还是体外实验中，相比于游离药物和无M2pep纳米粒，M2pep修饰的纳米粒都表现出更高效的TAMs摄取。这些结果表明，M2pep包裹可以增强纳米粒与M2-TAMs相互作用，促进药物的递送。

3 纳米递送系统同时靶向TAMs和肿瘤细胞治疗策略

在临床上，针对肿瘤细胞本身的治疗仍然是肿瘤药物治疗领域的主要手段。然而，单独靶向恶性细胞的疗法不仅效果不理想，还常常引起肿瘤对单一药物的耐药性。因此，针对肿瘤细胞和微环境中的主导免疫细胞（TAMs）的联合治疗策略备受关注。该策略具有以下优点［60-61］：（1）逆转免疫抑制型肿瘤微环境，削弱微环境介导的耐药性；（2）通过调节患者自身免疫对抗肿瘤，不良反应更低且药效更持久；（3）免疫疗法与肿瘤细胞靶向治疗的结合产生抗肿瘤协同药效。然而，分别多次施用针对两种细胞的不同药物常常引起治疗效果不同步、药物间相互干扰以及治疗依从性差等问题。利用纳米载体递送同种药物至肿瘤细胞和TAMs，不仅克服了多次给药带来的诸多困难，还可实现对两种细胞的同时靶向调控，达到更理想的联合治疗效果。

Chen等［62］根据叶酸受体在肿瘤细胞和TAMs表面的过表达，制备了基于叶酸偶联型羧甲基壳聚糖的双靶向siRNA递送系统，用于同时沉默TAMs和Lewis肺癌细胞（LLC）中具有细胞恶性转化作用的信号传导及转录激活蛋白3（signal trans⁃ducer and activator of transcription 3，STAT3）。实验结果表明，与非靶向纳米粒相比，双重靶向递送系统表现出更高的效力，致使两种细胞中STAT3的表达显著降低，从而成功实现TAMs向M1型的转变以及LLC的凋亡；同时，在体内实验中，肿瘤的生长被有效抑制，肿瘤组织中的M2-TAMs水平显著降低。Conde等［63］设计了一种基于M2pep的金纳米粒（AuNPs）用于siRNA的递送。在体内主动靶向TAMs，被动靶向肺癌细胞，从而在两种细胞中同时抑制血管内皮生长因子（vascular endotheli⁃al growth factor，VEGF）通路，引起TAMs减少和肿瘤细胞增殖抑制，其作用机制如图4所示。这种混合治疗方法表现出理想的双重基因敲除效果，且免疫记忆的产生可引起长效的肿瘤抑制和疾病控制，是一种高效的抗肿瘤免疫疗法。

4 总结与展望

TAMs是TME中最丰富的免疫细胞种群，由于与肿瘤生长、转移扩散和治疗失败密切相关，成为肿瘤免疫治疗的热门靶标。抑制TAMs募集、耗竭TAMs和使TAMs复极化3种策略均具有调控TAMs从而逆转免疫抑制性TME的可行性。同时，主/被动靶向型纳米载体的应用，进一步优化了TAMs靶向调控策略。然而，据报道，纳米粒到达肿瘤部位后，常常脱靶至TME中丰富的肿瘤细胞，使单独靶向TAMs的疗法不能达到理想的抗肿瘤效果［64-65］。因此，合理选择TAMs和肿瘤细胞中共同的靶点，并通过纳米载药技术同时靶向调控TME中两种重要细胞的治疗策略，已逐渐成为纳米制剂学与肿瘤免疫治疗相结合的新热点。

Figure4 Schematic of the combined silencing therapy in vivo viananoparticles targeting TAMs and cancer cells[63]

此外，TME中还存在多种其他免疫细胞，它们对于肿瘤增殖和转移同样起到关键作用。在未来的研究中，将M2-TAMs与其他免疫细胞（如T细胞、NK细胞等）的调控药物共载于纳米递送系统中，有望更高效地改善TME；与此同时，对纳米载体进行更多功能化修饰，改善药物的循环稳定性和生物分布，并实现可控的药物释放，将成为TME靶向调控策略的下一个研究方向。