衍生化HPLC法测定酒石酸伐尼克兰中甲醛和乙二醛的含量

时间：2024-07-28

管艺同，胡芃薇，邹文宇，陆宇婷，宋敏，杭太俊

（中国药科大学药物分析系，南京210009）

酒石酸伐尼克兰（varenicline tartrate）是辉瑞制药公司研发的一种成人戒烟药，商品名为畅沛（Champix）。伐尼克兰与α4β2尼古丁乙酰胆碱受体具有高度亲和力，结合后产生激动作用，同时阻断尼古丁与该受体结合，从而发挥戒烟作用［1］。酒石酸伐尼克兰的合成路线见图1［2］，其中7，8，9，10-四氢-8-（三氟乙酰基）-6，10-甲桥-6H-吡嗪并［2，3-H］［3］苯并氮杂䓬为合成过程中的重要中间体，以下简称中间体（intermediate）。

Figure 1 Synthetic route of vareniclinetartrate

乙二醛为酒石酸伐尼克兰合成过程中的起始原料之一，主要由乙二醇空气氧化法制备，同时含有副产物甲醛［3］。因此，在酒石酸伐尼克兰中同时易有甲醛和乙二醛残留。由于甲醛和乙二醛均具有神经毒性和致突变性［4-5］，属于基因毒性杂质，长期摄入会对人体造成损害。此外它们还会与药物中的氨基发生反应，产生降解杂质［6］。故需要对酒石酸伐尼克兰中残留的甲醛和乙二醛进行严格控制。

人用药品注册技术国际协调会议指南（ICH M7）［7］中甲醛的推荐口服限度为每日0.2 mg/kg。酒石酸伐尼克兰片的服药周期为3~6个月，参考欧洲药品管理局（EMA）［8-9］发布的基因毒性杂质限度指南，应采用毒理学关注阈值（TTC）每日5μg作为上述杂质的可接受限度。考虑到烟瘾复发的可能性，将每日允许最大摄入量设定为1.5μg。由于甲醛和乙二醛产生毒性的作用模式一致，故规定上述杂质限度的总和为每日1.5μg。按照酒石酸伐尼克兰日服用量2 mg计算，规定甲醛和乙二醛的在原料药中的限度各自为375μg/g。酒石酸伐尼克兰中甲醛和乙二醛含量的同时测定方法尚无文献报道。

药品中甲醛的测定方法主要有分光光度法［10］604、衍生化-高效液相色谱法［11］、衍生化-顶空气相色谱法［12］等。乙二醛的测定方法主要有分光光度法［13］和衍生化-高效液相色谱法［14］等。分光光度法灵敏度不高、选择性较低，且多为半定量方法，无法准确测定甲醛和乙二醛的含量。衍生化-顶空气相色谱法为操作较繁琐，且精密度和准确度较差。本研究利用甲醛和乙二醛均可与2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）反应的性质，选用柱前衍生化-高效液相色谱法，研究建立酒石酸伐尼克兰中基因毒性杂质甲醛和乙二醛含量的同时测定方法。

1 材料

1.1 药品与试剂

2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH，萨恩化学技术有限公司）；盐酸（南京化学试剂股份有限公司）；乙腈（天地化学试剂有限公司）；37%甲醛水溶液、40%乙二醛水溶液（阿拉丁试剂有限公司）；酒石酸伐尼克兰（批号：AFN21701、AFN21702、AFN21703）和中间体（批号：FN21701粗品、FN21702粗品、FN21703粗品、FN21701、FN21702、FN21703）（嘉逸医药有限公司）。

1.2 仪器

1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BS 21S分析天平（德国Satrious公司）；实验室超纯水机（南京妙之仪电子科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液配制及衍生化方法

2.1.1 衍生化试剂溶液称取2，4-DNPH约100 mg，置于50 mL量瓶中，加适量溶剂（乙腈-水，50∶50，下同）溶解后，加盐酸0.5 mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含2，4-DNPH约为2.0 mg和HCl 0.12 mmol的溶液，作为衍生化试剂溶液。

2.1.2 混合杂质对照品储备液取37%甲醛水溶液和40%乙二醛水溶液各约240 mg，分别精密称定，置于同一25 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含甲醛和乙二醛均约为3.75 mg的溶液。精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每毫升中含甲醛和乙二醛均约为37.5μg的溶液，作为混合杂质对照品储备液（现配现用）。

2.1.3 杂质限度对照溶液精密量取混合杂质对照品储备液250μL，置于10 mL量瓶中，加衍生化试剂溶液1 mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每毫升中含甲醛和乙二醛均约为0.94μg的溶液。置60℃水浴加热2.0 h，使甲醛和乙二醛与2，4-DNPH反应生成腙，放至室温后，用0.45μm滤膜过滤，作为杂质限度对照溶液。

2.1.4 供试品溶液取供试品约25 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加适量溶剂溶解，加衍生化试剂溶液1 mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀，制成每毫升中含主成分2.5 mg的溶液。置60℃水浴加热2.0 h，使供试品中残留的基因毒性杂质甲醛和乙二醛与2，4-DNPH反应生成腙，放至室温后，用0.45μm滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.2 高效液相色谱条件

采用C8色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈-水（50∶50）为流动相A，乙腈-水（95∶5）为流动相B，线性梯度洗脱（A∶B）：0 min（100∶0）→3 min（100∶0）→10 min（0∶100）→10.1 min（100∶0）→15 min（100∶0），流速1 mL/min，柱温30℃，进样盘温度10℃，自动进样20μL，检测波长380 nm。

2.3 条件的选择与优化

2.3.1 检测波长的选择经检测，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙的最大吸收波长分别为356 nm和437 nm，为实现同时测定，需兼顾二者并选择合理检测波长。取“2.1.3”项下的杂质限度对照溶液，分别在360，380和400 nm条件下进样测定，记录色谱图（图2）。结果表明，380 nm条件下甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙均有较好且相近的紫外响应，故选择380 nm作为检测波长。

Figure 2 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly⁃oxal-2,4-DNPH dihydrazone detected at different wavelengthes at limit reference concentration

2.3.2 衍生化反应条件优化醛与肼的反应属于羰基的亲核加成反应，衍生条件对反应程度有重要影响［15］。GB/T 2912.3－2009［16］中规定甲醛的衍生条件为于60℃水浴加热30 min。有研究表明，pH为5时，甲醛与2，4-DNPH反应最完全［15］。从酸种类、反应温度、反应时间、2，4-DNPH加入量、pH等方面探讨能够使甲醛和乙二醛充分、稳定且快速衍生化的最佳反应条件。

（1）酸种类的选择精密量取“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液500μL，置于2个10 mL量瓶中，加2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL，分别加0.12 mol/L盐酸溶液1 mL和1%乙酸溶液1 mL，加溶剂稀释至刻度，摇匀。置70℃水浴加热1.5 h，放至室温后，用0.45μm滤膜过滤，分别进样测定，记录色谱图。峰面积参数见表1，结果表明，表明采用盐酸能够显著提升乙二醛的转化效率，乙二醛全部生成专属性的衍生产物乙二醛-2，4-DNPH二腙，不生成乙二醛-2，4-DNPH单腙，故选择盐酸调节衍生化体系的pH。

（2）反应温度的选择精密量取“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液250μL，置于10 mL量瓶中，加2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL和0.12 mol/L盐酸溶液1 mL，加溶剂稀释至刻度，平行配制5份。分别置40、50、60、70和80℃水浴加热1.5 h，放至室温后，用0.45μm滤膜过滤，分别进样测定，记录色谱图。峰面积参数见图3，结果表明60℃条件下甲醛和乙二醛均充分反应，且溶剂相对不易挥发，故选择60℃作为反应温度。

Table 1 Peak areas(mAU)of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and glyoxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different derivation acid at limit referenceconcentration

Figure 3 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly⁃oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different derivation temperatureat limit referenceconcentration

（3）反应时间的选择精密量取“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液250μL，置于10 mL量瓶中，加2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL和0.12 mol/L盐酸溶液1 mL，加溶剂稀释至刻度，平行配制7份。分别置60℃水浴加热0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 h，放至室温后，用0.45μm滤膜过滤，分别进样测定，记录色谱图。峰面积参数见图4，结果表明2.0 h时甲醛和乙二醛均充分反应，且效率较高，故选择反应时间为2.0 h。

（4）2,4-DNPH加入量的选择精密量取“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液250μL，置于6个10 mL量瓶中，分别加0.12 mol/L盐酸溶液1 mL与2 mg/mL 2，4-DNPH溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1和1.5 mL（分别相当于体系中含2，4-DNPH 40、80、120、160、200和300μg/mL），加溶剂稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴加热2.0 h，放至室温后，用0.45μm滤膜过滤，分别进样测定，记录色谱图。峰面积参数见图5，结果表明，体系中含2，4-DNPH 200μg/mL时足以使1.88μg/mL的甲醛和乙二醛充分反应，故选择在反应体系中加入2 mg/mL 2，4-DNPH溶液1 mL。

Figure 4 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly⁃oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different derivation time at limit reference concentration

Figure 5 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly⁃oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different concentra⁃tion of 2,4-DNPH at limit reference concentration

（5）pH的选择精密量取“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液250μL，置于7个10 mL量瓶中，分别加2 mg/mL 2，4-DNPH 1 mL和0.12 mol/L盐酸溶液50、100、200、500、1 000、2 000和3 000μL（分别相当于体系中含HCl 0.6、1.2、2.4、6、12、24和36 mmol/L），加溶剂稀释至刻度，摇匀。置60℃水浴加热2.0 h，放至室温后，用0.45μm滤膜过滤，分别测定pH并进样测定，记录色谱图。峰面积参数见图6，结果表明，体系中含12 mmol/L HCl，即pH约为1.76时甲醛和乙二醛可充分反应，且主成分自身性质引起的pH波动基本不会造成影响，故选择在反应体系中加入0.12 mol/L盐酸溶液1 mL。

Figure 6 Peak areas of formaldehyde-2,4-DNPH hydrazone and gly⁃oxal-2,4-DNPH dihydrazone under the influence of different pH at limit reference concentration

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验在建立的HPLC条件下，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙（经ESIQ-TOF加合离子准确质量验证）的保留时间分别为5.67和9.15 min，各杂质衍生产物峰形尖锐、分离良好，空白溶剂、衍生化试剂和主成分对各杂质衍生产物的测定均无干扰（图7）。

Figure 7 HPLC chromatograms for simultaneous formaldehyde and glyoxal test

2.4.2 线性范围精密量取“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液25、50、75、100、125、175、250、375和500μL，分别照“2.1.3”项下方法制备杂质对照溶液（分别相当于限度浓度的10%、20%、30%、40%、50%、70%、100%、150%和200%）。照“2.2”项下条件进行测定，记录色谱图。以各杂质衍生产物的峰面积（A）对其质量浓度（c，μg/mL）进行线性回归，分别得到甲醛的回归方程为：A=416 783c+15 978（r=0.999 7）；乙二醛的回归方程为：A=568 473c+1 388.4（r=0.999 9）。结果表明，甲醛和乙二醛均在0.094~1.88μg/mL范围内线性关系良好，适用外标法计算供试品中的杂质含量。

2.4.3 检测限和定量限根据《中华人民共和国药典》（2020年版）通则9101［10］482中“响应值标准偏差和标准曲线斜率法”计算，甲醛和乙二醛的检测限均约为0.047μg/mL，定量限均约为0.094μg/mL。

为进一步验证，精密量取“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液25μL，照“2.1.3”项下的方法制成反应前各杂质质量浓度均为0.094μg/mL的对照溶液6份，照“2.2”项下条件进行测定，记录色谱图。结果表明，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙峰面积的RSD分别为0.5%和0.3%，均小于2%，符合灵敏度的要求。

2.4.4 准确度取已测定甲醛和乙二醛含量的中间体成品（批号：FN21701）约25 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加适量溶剂溶解，分别精密加入“2.1.2”项下的混合杂质对照品储备液125，250，375μL，照“2.1.3”项下的方法制成低（50%）、中（100%）、高（150%）浓度的加样回收率试验溶液，每个浓度各3份；同时照“2.1.3”和“2.1.4”项下的方法制备杂质限度对照溶液和供试品溶液各2份。取上述各溶液，照“2.2”项下条件进行测定，记录色谱图。按外标法以峰面积计算各杂质的质量浓度，分别计算加样回收率。

根据甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙的峰面积，计算测定甲醛和乙二醛的平均回收率分别为95.0%和99.4%，RSD分别为1.2%和2.6%。根据《中华人民共和国药典》（2020年版）通则9101［10］482中回收率限度的规定，100μg/g水平的杂质回收率应在85%~110%范围内，表明本法准确度良好。

2.4.5 精密度

（1）进样精密度照“2.1.3”项下的方法制备杂质限度对照溶液，照“2.2”项下条件连续进样6次，记录色谱图。结果表明，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙峰面积的RSD分别为0.1%和0.2%，均小于2%，表明仪器进样精密度良好。

（2）重复性照“2.4.4”项下的方法制备中浓度（100%）的加样回收率试验溶液6份，照“2.2”项下条件进行测定，记录色谱图。按外标法以峰面积计算各杂质的质量浓度，分别计算加样回收率。结果表明，甲醛和乙二醛的平均回收率分别为95.4%和101.7%，RSD分别为0.8%和2.7%。根据《中华人民共和国药典》（2020年版）通则9101［10］482中精密度可接受范围的规定，100μg/g水平的杂质重复性RSD在4%以内，表明本法精密度良好。

2.4.6 稳定性

（1）混合杂质对照品储备液稳定性取照“2.1.2”项下的方法新鲜配制的混合杂质对照品储备液，与在-20℃冰箱储存10 d的混合杂质对照品储备液适量，照“2.1.3”项下的方法制备成杂质限度对照溶液各3份，照“2.2”项下条件进行测定，记录色谱图。结果表明，6份杂质限度对照溶液中，甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙峰面积的RSD分别为0.7%和0.9%，均小于2%，表明在混合杂质对照品储备液-20℃放置10 d稳定。

（2）进样稳定性照“2.4.4”项下的方法制备低（50%）、高（150%）浓度的加样回收率试验溶液与不加样的低（50%）、高（150%）浓度的对照溶液。分别在0，2，4，6.5和10 h，照“2.2”项下条件进行测定，记录色谱图。结果表明，各溶液中甲醛-2，4-DNPH腙和乙二醛-2，4-DNPH二腙不同时间点峰面积的RSD分别为0.1%~0.2%和0.1%~0.3%，均不超过2%，表明杂质限度对照溶液和加样回收率试验溶液在10℃放置10 h内，均稳定。

2.5 样品测定

照“2.1.3”和“2.1.4”项下的方法配制杂质限度对照溶液和供试品溶液，照“2.2”项下条件进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各杂质的含量。结果见表2。结果表明，酒石酸伐尼克兰及其中间体成品中甲醛和乙二醛的含量均符合基因毒性杂质的限度要求，中间体粗品中乙二醛的含量易超过限度要求。所以，生产过程中的精制工艺对甲醛和乙二醛实现了有效控制。

Table 2 Test results of formaldehyde and glyoxal in different batches of vareniclinetartrate and intermediate