胰岛素和油酸促进结肠癌皮下移植瘤生长的代谢组学研究

张 颖，王 笛，张 培，张尊建，许风国

（中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，南京210009）

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，具有较高的疾病发生率和病死率［1］。据WHO统计，2020年全球新增结肠癌病例193万，死亡病例超过90万（https：//gco.iarc.fr/today/home）。流行病学研究表明糖尿病［2］、肥胖［3］等是结肠癌的重要风险因素，与结肠癌的发生发展密切相关。胰岛素［4］和脂肪酸代谢异常［5］可能是糖尿病和肥胖介导结肠癌发展的重要途径。Chen等［4］研究发现胰岛素可通过上调ACAT1的表达促进结肠癌细胞的增殖和迁移，而脂肪酸代谢异常（如油酸）可通过调节肿瘤增殖及侵袭相关蛋白的表达介导肿瘤发生［6-7］。课题组前期研究发现，胰岛素和油酸联用可以协同促进结肠癌细胞HCT116的增殖和迁移。综上，胰岛素和油酸均可以在一定程度上促进结肠癌的发生发展，但二者对结肠癌代谢轮廓的影响尚不明确。因此，本研究从小分子代谢物角度出发，对胰岛素和油酸给药后HCT116细胞皮下移植瘤裸鼠血清样本进行非目标代谢组学研究，旨在寻找差异代谢物并为结肠癌的临床诊治提供理论参考。

1 材料

1.1 试剂及药品

N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA，含量大于99.9%）、盐酸甲氧胺（MOX，含量大于99.9%）及吡啶（美国Sigma-Aldrich公司）；甲醇、乙腈及乙酸乙酯（色谱纯）（德国Merk公司）。精蛋白生物合成人胰岛素注射液（预混30R）［诺和诺德（中国）制药有限公司］；油酸（分析纯，上海易恩化学技术有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

GC/MS-QP2010 Ultra气质联用仪、UFLC-ITTOF/MS液质联用仪（日本岛津公司）；CentriVap®离心浓缩仪（美国Labconco公司）；TMS-200恒温混匀仪（杭州奥盛仪器有限公司）；5430R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；Milli-Q纯水制备系统（美国Millipore公司）。

1.3 细胞株及动物

人结肠癌细胞HCT116购自南京宏新生物科技有限公司，经上海翼和应用生物技术有限公司鉴定，样品编号20191106-01。SPF级雄性BALB/c Nude裸鼠24只，5周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有动物实验均经中国药科大学伦理委员会批准，操作规程符合动物保护与使用要求，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2021-0011。

2 方法

2.1 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

动物自购进后于SPF级环境饲养5～7 d以适应实验环境，期间自由饮食，维持环境温度为（24±2）℃以及12 h/12 h昼夜循环。

常规培养人结肠癌细胞HCT116，收集对数生长期细胞，并以无血清培养基重悬，调整细胞密度为每毫升5×107个，置于冰上备用。无菌条件下，采用1 mL注射器吸取HCT116细胞悬液0.2 mL注射于每只裸鼠腋窝皮下组织，注射完毕后，裸鼠自由饲养，待细胞定植后开展后续实验。

2.2 动物分组及给药

所有实验动物随机分为4组，每组6只，分别为对照组（CON）、胰岛素单独给药组（INS）、油酸单独给药组（OA）、胰岛素及油酸联合给药组（IO）。对照组给予空白溶媒；INS组给予胰岛素；OA组给予油酸；IO组均同时给予胰岛素和油酸。另外，为防止胰岛素引起的低血糖，INS和IO组均给予10%葡萄糖水溶液替代饮水。胰岛素以每日2.5 U/kg的剂量皮下注射方式给药；油酸以每日2.0 g/kg的剂量灌胃给药。首先进行为期10 d的预给药处理以营造高胰岛素和高油酸内环境，模拟2型糖尿病病理环境。10 d预给药结束后暂停给药，于第11天皮下注射HCT116细胞，建立裸鼠移植瘤模型。随后进行为期6 d的细胞定植，待细胞定植成功且移植瘤生长到体积为100 mm3左右时继续给药。对照组、INS组、OA组以及IO组给药方式如前。待平均肿瘤体积达到1 000 mm3左右时处死动物，取血清样本进行非目标代谢组学分析。

2.3 非目标代谢组学分析

2.3.1 样品前处理

LC-MS样品前处理：4℃解冻血清样品，涡旋后取20μL，加入含5μg/mL格列本脲（内标）的乙腈溶液100μL沉淀蛋白，涡旋，4℃，14 000 r/min，离心10 min，吸取上清液，以相同的条件再次离心，取上清液于进样小瓶，待LC-MS分析。

GC-MS样品前处理：4℃解冻血清样品，涡旋后取10μL，加入含10μg/mL十七酸（内标）的甲醇溶液100μL，涡旋5 min，4℃，14 000 r/min离心2次，每次10min，取上清液80μL。在上清液中加入10 mg/mL MOX溶液25μL，涡旋1 min，37℃振荡反应1.5 h，50℃真空干燥2 h，加入MSTFA-乙酸乙酯（1∶4）溶液120μL，涡旋1 min，37℃振荡反应2 h，将反应产物转移至进样小瓶，待GC-MS分析。

质量控制样本（QC）制备：从每份待测样本中取相同体积血清，混匀，作为QC样本。QC样本前处理方式与其他待测样本一致。仪器分析时，每4～6个待测样本插入1个QC样本，监测仪器和分析方法的可靠性。

2.3.2 LC-MS及GC-MS分析

LC-MS分析：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；流速为0.4 mL/min；梯度洗脱（0～20 min，95%～5%A；20～23 min，5%A；23～30 min，95%A）；柱温：40℃；进样器温度：4℃；进样量：5μL。离子源为电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）；正、负离子模式同时采集数据，质量扫描范围：m/z100～1 000；检测电压：1.8 kV；离子源接口电压：正极4.5 kV，负极-3.5 kV；加热模块（heat block）温度：200℃；曲线脱溶剂管（CDL）温度：200℃；雾化气（氮气）速率：1.5 L/min；干燥气（氮气）压力：170 kPa。

GC-MS分析：色谱柱为Restek®Rtx-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；程序升温（0~2 min，70℃；2~27 min，70~320℃；27～29 min，320℃）；进样口温度：250℃；载气（99.999 6%氦气）线速：36.7 cm/s；进样量：1μL（分流比20∶1）。电子轰击离子源（electron impact ionization，EI）电压：70 eV；离子源温度：200℃；接口温度：250℃；溶剂延迟时间：5 min；质量扫描范围：m/z45～600；采用全扫描模式采集数据。

2.3.3 代谢组学数据处理及差异代谢物鉴定原始数据经Profiling Solution软件处理后导出，经扣空白、缺失值填补、面积归一化等数据前处理，导入SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析（princi⁃pal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal projection to latent structures-dis⁃criminant analysis，OPLS-DA）。PCA得分图用于观察QC样本的聚集程度。OPLS-DA模型用于两组间差异离子筛选，模型中VIP>1的离子，需进一步满足Mann-Whitney U检验P<0.05和|Fold Change|>1.5（FC，给药组/空白组）。LC-MS差异离子经文献和HMDB数据库（The Human Metabo⁃lome Database，http：//www.hmdb.ca）比对，并结合实验室代谢物库进行差异代谢物鉴定；GC-MS差异离子则通过NIST11.library及标准品比对鉴定。

3 结 果

3.1 胰岛素和油酸对促进裸鼠结肠癌细胞皮下移植瘤增殖的影响

结肠癌细胞HCT116皮下移植瘤实验表明，胰岛素和油酸同时给药可以促进裸鼠皮下移植瘤增殖。最后一次给药结束后处死裸鼠，剥离瘤体，并对其重量进行测定。结果表明IO组瘤体最重，与INS组及OA组存在显著性差异（图1-A）。另外裸鼠处死前各组体重测量结果表明，IO组裸鼠体重最低，且与CON组存在显著性差异，而INS组及OA组与CON组体重无显著差异（图1-B），这一现象与肿瘤体重结果相符，说明肿瘤的异常增殖导致裸鼠身形瘦弱且体重降低。

3.2 非目标代谢组学方法验证

利用Profiling Solution软件对GC-MS、LC-MS原始图谱数据进行峰提取（图2），数据经预处理后导入SIMCA-P 14.1软件进行多元统计分析。LCMS和GC-MS裸鼠血清代谢轮廓谱PCA得分图表示QC样本聚集良好（图3-A，图3-C），且不同样本中内标稳定，在正常范围内波动（图3-B，图3-D），说明仪器稳定、方法和结果可重现度高。

3.3 差异代谢物筛选

3.3.1 胰岛素和油酸单独给药差异代谢物筛选对LC-MS和GC-MS数据进行OPLS-DA分析，筛选满足VIP>1、Mann-Whitney U检验P<0.05和|FC|>1.5的离子进行代谢物鉴定。结果显示，INS组与OA组代谢轮廓和CON组相比，均未发生显著改变，未筛选出符合条件的差异代谢物。IO组与OA（图4-A，图4-B）或INS组（图4-C，图4-D）相比，均呈现出一定程度的差异。其中，IO组与INS组相比，琥珀酸、谷氨酸、3-磷酸甘油及LysoPC（20∶3）含量显著降低，胆固醇含量显著升高（表1，图5-A）；IO组与OA组相比，缬氨酸、尿素、异亮氨酸、胆固醇含量显著升高，琥珀酸、LysoPC（20∶2）及L-乙酰肉碱含量显著降低（表1，图5-B）。以上结果表明，胰岛素或油酸单独给药与二者联合给药对结肠癌血清代谢轮廓影响不同。

Figure 1 Tumor weight(A)and body weight(B)of nude mice following subcutaneous transplantation of colon carcinoma cell HCT116(xˉ±s,n=6)CON:Control;OA:Oleic acid(2.0 g/kg);INS:Insulin(2.5 U/kg);IO:Insulin(2.5 U/kg)plus oleic acid(2.0 g/kg)

Figure 2 Typical total ion chromatogram(TIC)of nude mice serum samples analyzed by LC-MS(ESI+)(A),LC-MS(ESI-)(B),and GC-MS(C)

Figure 3 3-Dimensional PCA score plots from(A)LC-MSand(C)GC-MSdata;and peak area of internal standard in all samples from(B)LC-MS and(D)GC-MSdata

3.3.2 胰岛素和油酸联合给药差异代谢物筛选LC-MS和GC-MS分析结果表明IO组与CON组存在较为显著的组间差异（图4-E，图4-F）。胰岛素及油酸联合给药使裸鼠体内阿拉伯糖、鞘氨醇及L-乙酰肉碱含量显著降低，而尿素及胆固醇含量升高（表1，图5-C），揭示二者联用扰乱了机体原有的代谢平衡状态，引起代谢失调紊乱。尿素是体内氨基酸代谢产物，而鞘氨醇、L-乙酰肉碱和胆固醇是脂类代谢相关物质，因此，推测胰岛素和油酸联用引起糖脂代谢及氨基酸代谢异常，从而对结肠癌发生发展产生影响。

Figure 4 OPLS-DA scoreplots from LC-MSdata(A,C,E)and OPLS-DA scoreplots based on GC-MSdata（B,D,F）

4 讨 论

本研究发现，同时给予HCT116细胞皮下移植瘤裸鼠胰岛素和油酸，血清中胆固醇含量显著提高。胆固醇是哺乳动物细胞膜组成以及维持膜完整性和流动性的主要脂类成分之一［8］，已有研究发现，胆固醇异常代谢在一定程度上为肿瘤细胞的增殖和侵袭提供物质和能量基础［9］。还有研究揭示，胆固醇可以通过调节miR-33a-PIM3途径促进结肠癌细胞增殖及细胞周期转变，并抑制细胞凋亡［10］，在结肠癌的发生发展中发挥重要作用。在前列腺癌研究中，胆固醇氧化代谢产物27-羟基胆固醇则可以通过刺激雌激素受体β促进前列腺癌细胞的增殖［11］。另外，胆固醇可以通过激活LXRα/β促进卵巢癌化学耐药的发生［12］，从而影响化疗效果。因此，靶向胆固醇合成代谢通路相关蛋白进行药物干预有望成为肿瘤治疗的新手段［13］。

Figure5 Histogramsof relativecontent in nudemiceof differential metabolitesscreened fromdifferent comparisons

Table1 Differential metabolites in serum of nudemice after administration

此外，本研究发现另一种参与体内脂肪酸转运的物质L-乙酰肉碱，在IO组含量显著下调，提示体内L-乙酰肉碱水平可能与肿瘤恶化程度呈现负相关的趋势。有研究证实，饮食补充肉碱和乙酰肉碱可以减轻小鼠DSS结肠炎相关结肠癌的严重程度［14］。研究人员发现乙酰肉碱可以增强丁酸盐的抗结肠癌效果［15］。并且，L-乙酰肉碱还表现出抗肿瘤血管生成的作用［16］。以上研究结果说明胰岛素和油酸所引起的结肠癌小鼠代谢紊乱与肿瘤恶化具有一定相关性，提示异常的代谢物水平可以作为临床肿瘤风险评估的依据，对疾病的早期诊断具有指导意义。

糖尿病、肥胖等疾病是肿瘤的风险因素［17］，特殊的病理环境对肿瘤细胞的增殖和浸润存在较大的影响。已有研究发现亚油酸预处理可以提高MDA-MB-231细胞对胰岛素的应答［18］，说明在高亚油酸环境中，胰岛素促进肿瘤细胞恶性表型的作用显著提高，证明环境因素在肿瘤进程中的重要作用。本研究发现，同时给予荷瘤鼠油酸及胰岛素时，其体内代谢轮廓发生变化，而胰岛素和油酸单独给药并未造成显著的代谢改变，说明二者同时存在才会对结肠癌的代谢产生较为重要的影响，油酸及胰岛素对结肠癌代谢轮廓的调节具有条件依赖性。因此，对于临床结肠癌患者，在其诊断过程中应充分了解患者的疾病史以及饮食偏好等，若其本身同时患有高胰岛素血症或出现体内胰岛素过度分泌的情况，应当注意饮食，降低含油酸较高的食物的摄入，尽量选择低脂饮食，从而避免因机体代谢紊乱而加重肿瘤发展。

本研究建立了结肠癌细胞HCT116皮下移植瘤模型，对胰岛素及油酸给药后的荷瘤鼠血液样本进行非目标代谢组学分析，发现胰岛素和油酸联合给药促进了结肠癌发展，扰动了血清代谢物轮廓，相关结果为进一步研究糖尿患者结肠癌发病机制奠定了基础，也可为结肠癌患者的临床诊断和治疗提供参考。