基于网络药理学和分子对接法研究六堡茶干预COVID-19的活性成分

周丹水，陈小雪，吴志敏，倪维鞠，邱瑞瑾，于翠平，蓝伦礼，王颖芳，陈守登，曾 宇*

（1广东药科大学中药学院，广州510006；2中山大学附属第五医院广东省生物医学影像重点实验室，珠海519000；3梧州市农业科学研究所，梧州市六堡茶研究院，梧州543002；4桂林医学院药学院，桂林541199）

世界卫生组织于2020年2月11日将新型冠状病毒感染引起的肺炎命名为“COVID-19”（coronavirus disease 2019），其病毒被命名为SARS-CoV-2［1］。在我国及日本、韩国、意大利、美国等国家流行，此次引起流行的病原为一种新发现的β属冠状病毒，感染患者会出现以下主要临床症状：发热、咳嗽、乏力及呼吸困难等，重症感染患者则出现呼吸窘迫综合征及脓毒性休克等，甚至造成死亡［2］。截至2020年3月31日，全球流行病病例报告，累计确诊病例1 033 666例，累计死亡病例54 360例。目前，临床治疗尚无特效的药物与疫苗，其治疗方案主要采用抗病毒药物，如洛匹那韦、利托那韦及利巴韦林等，尚无循证依据支撑。相比之下中医具有整体观与辨证论治的特点及优势。中医各名家分析COVID-19属于“疫病”范畴，其病机涉及寒湿郁肺、湿热蕴肺、湿毒郁肺。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行）》第3～7版中，中药以及成方制剂均发挥了较好的疗效。《神农本草经》中有“神农尝百草，一日遇七十二毒，得茶而解之”的记载。六堡茶原料为山茶科植物茶树（Camellia sinensis L.O.Kunts）的鲜叶，属黑茶类，选用苍梧县群体种、广西大中叶种及其分离、选育的品种、品系茶树的鲜叶为原料，按特定的工艺进行加工，具有独特品质特征的后发酵茶。六堡茶具有消暑祛湿、明目清心、帮助消化的功效。“湿”是COVID-19病机中的关键因素，对于湿邪内生所致疫病的治疗应以兼顾清热与化湿为要，并强调固护中焦脾胃［3］，与六堡茶独特的清热祛湿功效具有一定联系。

网络药理学，作为系统生物学和多向药理学等多学科交叉的新兴学科，其整体性和系统性与中医药理论高度贴切，也符合了现代医学的主题［4-5］。分子对接技术融合了结构分子生物学和计算机辅助药物设计，通过对接配体-蛋白预测配体与已知三维结构蛋白的主要结合方式以及结合亲和力，已经被广泛用于筛选活性结构，发现与优化潜在先导化合物等药物设计方面［6］。上海科技大学饶子和、杨海涛团队快速解析了SARS-CoV-2 3CL水解酶（Mpro）的晶体结构，被认为是SARSCoV-2病毒的有效靶点，为筛选抗SARS-CoV-2的活性成分提供了基础。Mpro在新冠病毒复制和转录周期中起关键作用，是冠状病毒的潜在作用靶点［7-8］，寻找 Mpro抑制剂成为 COVID-19 干预的关键。本研究拟通过网络药理学技术联合分子对接实验验证，系统探讨了六堡茶中干预COVID-19的核心药效成分、关键靶标及信号通路，为后期六堡茶的药理作用机制研究及其开发提供参考，同时为COVID-19提供新的预防及治疗方案。

1 材 料

1.1 试剂

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、三羟基甲基氨基甲烷［Tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris base］、氯化钠、咪唑、2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol，BME）、LB培养基（美国西格玛奥德里奇公司）；荧光底物MCA-AVLQ↓SGFR-Lys（Dnp）-Lys-NH2、苯甲 基磺酰（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 仪器

镍离子金属螯合色谱柱（Ni sepharose 6 fast flow）、Hitrap Q FF column阴离子交换色谱柱、HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝胶过滤色谱柱（美国思拓凡公司）；发光板（广州洁特生物过滤有限公司）；EnVision多模式微孔板检测仪（美国珀金埃尔默仪器有限公司）。

1.3 软件

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）［9］（http：//tcmspw.com/）；化 学 专 业 数 据 库（http：//www. organchem. csdb. cn/scdb/default.asp）；UniProt数据库［10］（https：//www.uniprot.org/）；GeneCards数据库［11］（http：//www.genecards.org/）；DAVID 数 据 库［12］（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）；Metascape 数 据 库［13］（http：//metascape.org/gp/）；STRING 数 据 库［14］（https：//string-db.org/）；PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）；PubChem 数据 库［15］（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Cytoscape 3.7.1 软件［16］；AutoDock Vina 1.1.2［17］软件；Pymol软件；Chem3D软件；Graphpad Prism 8软件；Omishare在线绘图（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）；Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）。

2 方 法

2.1 六堡茶相关化合物的收集与筛选

本研究通过相关文献阅读结合TCMSP数据库对六堡茶的化学成分进行收集与整理。根据ADME原理，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是指药物经口服给药后吸收进入全身血液循环的相对量，一般认为高口服生物利用度是衡量生物活性分子成药性的重要参数；类药性（druglikeness，DL）指的是体现化合物与已知药物的相似性，是评价化合物是否可作为药物的重要指标［18］。化合物的OB、DL越高，说明该化合物越有临床药用的价值。根据TCMSP数据库的推荐，以OB≥30%、DL≥0.18作为六堡茶活性化合物的筛选条件，筛选出符合条件的活性化合物。

2.2 “六堡茶－成分－靶标”网络的构建

将“2.1”项中筛选出的六堡茶活性化合物借助TCMSP数据库预测各活性化合物作用靶标，然后将靶标蛋白名导入Uniprot数据库，以“reviewed”“human”作为筛选条件进行靶标蛋白与对应人源物种标准基因名的转化。将六堡茶活性成分的预测作用靶标导入Cytoscape 3.7.1软件构建“六堡茶－成分－靶标”网络并对此进行可视化展示和拓扑参数分析。

2.3 COVID-19疾病靶点的获取

通 过 GeneCards数 据 库 ，以“coronavirus”“pneumonia”为关键词对新冠肺炎的靶点进行收集，将两个关键词检索出来的疾病靶点取并集，剔除重复基因后作为COVID-19疾病靶点集以用于后续分析。使用Venny 2.1网站将六堡茶活性成分的作用靶标与所得的疾病靶点集进行匹配取两者的交集基因，得到六堡茶潜在干预COVID-19的靶点集。

2.4 六堡茶潜在干预COVID-19的作用靶标的蛋白质相互作用网络及核心靶点的筛选

STRING数据库是一个在线搜索已知蛋白质相互作用关系的数据库。将六堡茶潜在干预COVID-19的靶点集导入STRING数据库，物种选择为“Homo sapiens”，设置高置信度（“high confidence（0.700）”），获得蛋白相互作用关系（proteinprotein interaction，PPI）网络图，并隐藏在该网络中与其他靶标无互作关系的靶标。随后利用Cytoscape 3.7.1软件中的“network analysis”功能对靶点PPI网络图进行分析。以节点连接度（degree）、中心节点介度（betweenness centrality）、中心节点紧密度（closeness centrality）为筛选条件筛选出核心靶标，并将多重筛选的过程进行可视化。将筛选出来的核心靶标导入Cytoscape 3.7.1软件中进行拓扑学分析，并使用该软件的mcode插件对PPI网络进行聚类分析。

2.5 对核心靶点进行GO（gene ontology）富集分析和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析

为了进一步挖掘六堡茶干预COVID-19的核心靶点在生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）、细胞组成（cellular component）以及KEGG通路中发挥的作用。本研究将“2.4”项中筛选出来的核心靶标分别导入DAVID和Metascape数据库中，将所有靶标基因校正为官方标准基因名，选定物种为“Homo sapiens”。对核心靶标进行GO富集分析和KEGG通路富集分析后，将上述两个数据库的富集结果综合并进行可视化处理。

对自我羞耻控制条件和羞耻条件的亲社会行为评分进行配对样本t检验(见表2)，结果显示，羞耻条件的亲社会行为评分显著高于控制条件的评分，t(29)=3.44，p<0.01，Cohen’d=0.62，说明羞耻情绪的诱发促进了大学生的亲社会行为。个体体验到羞耻情绪后想要从负性情绪中逃离出来，而亲社会倾向能够与他人建立良好的关系，注意力得到转移。因而在体验到羞耻情绪后，个体具有做出亲社会行为的倾向。

2.6 分子对接验证

从PubMed数据库获取六堡茶活性化合物小分子配体结构，将其导入到Chem3D软件进行能量最小化，保存为*pdb格式。通过PDB数据库下载SARS-CoV-2 3CL水解酶（Mpro，PDB ID：6LU7）*pdb格式的蛋白结构（该结构由上海科技大学饶子和、杨海涛课题组解析）。采用Pymol软件对受体蛋白进行加氢、移除溶剂分子、分离原配体等预处理，再借助Autodock tool对蛋白质受体进行原子类型定义、电荷计算、非极性氢合并，最后输出为*pdbqt格式。将Mpro自带的配体视为活性结合位点，根据该位点设置grid box大小和坐标最后运用Autodock Vina 1.1.2进行对接。根据亲和力（affinity）筛选出最佳构象后用Pymol软件对结果进行可视化以及分析。

2.7 SARS-CoV-2 3CL水解酶的异源重组表达与纯化

根据文献［19］报道，将野生型全长Mpro（Gen-Bank，MN908947.3）构建至 pGEX-6p-1表达质粒，重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中。选取单克隆接种于含氨苄（100 μg/mL）、氯霉素（34 μg/mL）的LB培养基100 mL中，于37℃过夜培养，按1∶100的比例转接至含有含氨苄（100 μg/mL），氯霉素（34 μg/mL）LB培养基1 L的摇瓶中，37℃培养至A6000.7～1.0，于4℃静置降温30～60 min加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG，16℃诱导表达过夜。18℃，5 000 r/min，12 min离心培养液收集菌体，用裂解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L NaCl，30 mmol/L咪唑，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L BME）重悬，低温超高压细胞破碎仪裂解。4℃，18 000 r/min，50 min高速离心裂解液，上清液用0.2 μm的滤膜过滤，将上清液进行镍离子金属螯合色谱，用洗涤液（20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L NaCl，30 mmol/L 咪 唑 ，2 mmol/L BME）去除杂蛋白，再以洗脱液（20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），500 mmol/L NaCl，300 mmol/L咪唑，2 mmol/L BME）洗脱目标蛋白。以人鼻病毒3C蛋白酶切6×His标记的Mpro，去除6×His标签，用SDS-PAGE鉴定酶切结果。随后进行Hitrap Q FF column阴离子交换色谱及HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝胶过滤色谱［20］。纯化的蛋白保存于50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.3），1 mmol/L EDTA，通过SDS-PAGE检测蛋白纯度后将其分装并于-80℃保存。

2.8 （-）-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对SARS-CoV-2 3CL水解酶的酶活性抑制试验

酶活性抑制实验在过往研究中已有报道［21］。本实验的荧光底物为MCA-AVLQ↓SGFR-Lys（Dnp）-Lys-NH2，其中↓为Mpro酶切位点，反应缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.3），1 mmol/L EDTA）。用反应缓冲液配制和稀释1 mmol/L EGCG和4 μmol/L的Mpro母液，用二甲基亚砜配制400 μmol/L荧光底物母液。在发光板中加入终浓度为0～40 μmol/L的EGCG，再加入终浓度0.2 μmol/L Mpro。30℃振荡孵育2 min，随后于冰上静置5 min。快速加入终浓度为20 μmol/L多肽底物，30℃振荡孵育5 s后，立即以激发光320 nm，发射光405 nm进行荧光检测。每个浓度进行3次平行检测，因EGCG自身有荧光，故设定只含EGCG（不含Mpro和底物）为空白组，进行实验结果校正。抑制率（%）=（1-实验组的反应初速率/不含EGCG的对照组的反应初速率）×100。通过对各浓度的时间-荧光强度曲线中的前400 s进行线性拟合，所得斜率即为各组浓度的酶反应初始速率，从而计算不同浓度EGCG对Mpro的抑制率。实验数据采用Graphpad Prism 8软件进行分析。

3 结 果

3.1 六堡茶有效成分的筛选结果

通过相关文献以及结合TCMSP，共整理得到468种六堡茶成分。按照OB≥30%、DL≥0.18筛选条件以及剔除无预测靶点的化合物，得到6个活性成分，其中有3种属于儿茶素类（表1）。

Table 1 Active ingredients of Liupao tea

（Continued）

3.2 “六堡茶－成分－靶标”网络的分析

通过排除无对应人源物种标准基因名的靶标蛋白及删除重复基因靶点，得出的6个六堡茶活性成分对应靶点与疾病相关靶点取交集，所得共同靶点112个。在“六堡茶－成分－靶标”网络进行拓扑学分析结果中，节点（node）表示有效成分和靶点基因，边数（edge）表示节点与节点之前的连接，连接度（degree）是在网络分析中刻画节点中心性（centrality）的最直接度量指标。一个节点的连接度越大就意味该节点在网络中就越重要。中心节点介度（betweenness centrality）是以经过某个节点的最短路径数目来刻画节点重要性的指标。中心节点紧密度（closeness centrality）反映在网络中某一节点与其他节点之间的接近程度。如图1可知，该网络共有节点163个，其中紫色方形代表六堡茶活性成分，绿色圆形代表作用靶标，浅黄色菱形代表六堡茶。从图中可知，六堡茶中存在一个化合物对应多个靶点及多个化合物共同作用于一个靶点，体现了药物多成分多靶点共同作用的复杂体系。

Figure 1 Compound-Target network diagram of active compounds of Liupao tea

3.3 核心靶标的筛选及其蛋白质相互作用网络分析

六堡茶潜在干预COVID-19的靶点集导入STRING数据库，并运用Cytoscape 3.7.1软件中的“network analysis”功能对靶点PPI网络进行分析后，将节点连接度、中心节点介度、中心节点紧密度作为筛选条件对112个靶标进行筛选，筛选出MAPK1、IL-6、TP53、TNF等38个核心靶标。从图2中可以看到，彼此两个蛋白之间的连线不止一条，这表示蛋白之间存在多种相互作用关系。对这38个核心靶标的PPI网络进行拓扑分析后，其中节点连接度排名前五的核心靶标分别为STAT3、MAPK1、RELA、EGFR和MAPK3。然后运用 Cytoscape 3.7.1软件对38个核心靶标的PPI网络进行分解，识别到网络中有4个连接紧密的子模块，这种子模块代表某些功能密切相关的蛋白之间相互作用而完成某种特定的分子功能。

3.4 关键靶点的GO富集分析和KEGG通路富集分析

从本研究的GO富集分析结果（图3）可知，根据显著性程度P＜0.01确定了523个GO条目。其中核心靶点富集在生物过程中的有445个GO条目，主要包括对脂多糖的应答、对药物的反应、细胞对DNA损伤刺激的反应、细胞对缺氧的反应等；富集在细胞组分中的包括膜筏、线粒体、胞质、核浆等24条；富集在分子功能中的包括蛋白质结合、泛素蛋白连接酶结合、转录因子结合、蛋白磷酸酶结合等54条。在显著性程度P＜0.01的基础上，以基因富集数排序，生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）、细胞组成（cellular component）各选取排名前10的GO条目进行可视化。

3.5 六堡茶活性成分作用于SARS-CoV-2 3CL水解酶的分子对接

Autodock Vina软件采用半经验打分方程对分子配体与受体蛋白结合的能力进行评估，两者结合的能量越低，越有利于构象的稳定。当结合能小于等于-5.0 kJ/mol时，一般认为配体和受体结合较好。由对接结果可知，六堡茶的6个活性化学成分：（+）-儿茶素、（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯、α-菠甾醇、（-）-儿茶素没食子酸酯、角鲨烯、氯化天竺葵素，与Mpro结合能均小于-5.0 kJ/mol，如表2所示，与受体蛋白Mpro结合较好，结合位点均与原配体N3抑制剂所在的结合口袋区域相近，由此提示六堡茶具有发挥干预新型冠状病毒的潜在作用，且结合能与目前使用较多的部分抗病毒药物相近，如图5所示。

3.6 （-）-表没食子儿茶素没食子酸酯对SARSCoV-2 3CL水解酶活性抑制试验

Figure 3 GO（gene ontology）enrichment analysis of the core target of Liupao tea BP:biological process;MF:molecular function;CC:cellular component

Figure 4 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）pathway enrichment analysis of the core target of Liupao tea

Table 2 Docking results of active ingredients and some chemical drugs with SARS-CoV-2 3CL hydrolase(Mpro)

Figure 5Molecular docking of SARS-CoV-2 3CL hydrolase（Mpro）with N3 inhibitor（A），（+）-catechin（B）,（-）-epigallocatechin gallate（C），α-spinasterol（D），（-）-catechin gallate（E），squalene（F）and pelargonidin chloride（G）

SARS-CoV-2冠状病毒主蛋白酶原核表达后，经镍离子金属螯合色谱、Hitrap Q FF column阴离子交换色谱、HiLoad 16/600 Superdex 75 pg凝胶过滤色谱分离纯化，14%SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白的纯度可达95%以上（由中山大学附属第五医院广东省生物医学影像重点实验室陈守登研究员课题组测定），如图6所示。图7-A为不同浓度的EGCG加入到酶反应混合物后对荧光强度的影响，通过荧光强度的变化可以反映EGCG对Mpro的抑制活性。不同浓度的EGCG与SARS-CoV-2 3CL水解酶抑制率的关系如图7-B所示，计算IC50为3.4 μmol/L。

4 讨 论

Figure 6 SDS-PAGE analysis of SARS-CoV-2 3CL hydrolase（Mpro）A:Identification of Mproby 12%SDS-PAGE.1:Marker,2:Mpro-wt which cleavage by rhinovirus 3C-like protease,3:Mproafter the cleavage of C-terminal His tag;B:Purification of Mproby 14%SDS-PAGE

Figure 7 Inhibition of（-）-epigallocatechin gallate（EGCG）for SARS-CoV-2 3CL hydrolase(-x ± s,n=3)A:Effect of different concentrations of EGCG on fluorescence intensity;B:Inhibitory activity of EGCG on SARS-CoV-2 3CL hydrolase.The inhibition rate was acquired by the calculation of initial rates calculated by fitting the straight-line portion of the curves(the first 400 second)in A

从中医角度分析，COVID-19为外感风热性质的疫疠之气所致，属于“湿毒疫”范畴，病位主要在肺，可波及脾胃，内湿从生，热湿相合。由于在不同患者或同一患者的不同病程中表现出寒湿与湿热。湿邪为中医学致病因素之一，湿邪致病具有4个方面的特性：湿为阴邪，易阻遏气机，损伤阳气；湿性重浊；湿性黏滞；湿性趋下，易伤阴位。而“湿”产生的根本在于脾胃，异气侵袭人体后易于侵犯脾胃［3，22］。唐代医学家陈藏器在《本草拾遗》中有写道：“止渴除疫，贵哉茶也”。通过长期饮茶改善人们的湿邪体质，健脾和胃不失为一种适宜方法。作为药食同源的六堡茶，茶气足，入肾经，走督脉，提振阳气；微生物菌群丰富，助小肠受盛化物；双管齐下，祛湿尤佳。六堡茶茶树原本生长的环境使它自带有祛湿的功效，更因其独特的渥堆加工工艺具有独特的祛湿功效。

本研究以独特祛湿功效的六堡茶为研究对象，以部分抗病毒药物和原配体N3抑制剂为对照，通过OB和DL筛选出6种六堡茶潜在活性成分，预测直接抑制SARS-COV-2复制的机制。为了进一步探讨这6个关键活性成分与新型冠状病毒的相关性，研究进行了分子对接验证。结果发现，6种活性成分与SARS-CoV-2 3CL水解酶均能较好地结合。值得注意的是，其中（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯是对应靶标最多的成分，在六堡茶的茶多酚含量中占比较大［23］，也是与SARS-CoV-2 3CL水解酶结合较好的成分。儿茶素属于茶多酚类化合物，是茶叶中的主要活性成分，有学者发现儿茶素可以抑制流感病毒的复制，具有抗病毒功效［24］。多数研究证明（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用［25］，可缓解感染肺炎链球菌小鼠的肺水肿症状［26］。有实验研究证明广藿香对脂多糖诱导的炎症有显著的抗炎作用，其中缺少不了α-菠甾醇的存在［27］，且角鲨烯是一种开链三萜类化合物，还具有增强机体免疫能力、抗肿瘤等多种生理功能［28］。

为了进一步探究六堡茶主要是通过哪些靶标对COVID-19起作用，本研究通过3个拓扑学参数对PPI网络进行筛选，得到MAPK3、MAPK1、TNF 、IL6、CASP3、EGFR 、STAT3等38个核心靶点。其中MAPK1、MAPK3都属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，能对高或低渗透压、氧化应激、DNA损伤等潜在有害的非生物应激刺激做出反应，可调控炎症、细胞生长、分化、凋亡及对环境的应激适应等多种重要的细胞生理或病理过程［29］。MAPK主要有ERK、p38 MAPK和SAPK/JNK三大亚型。有研究发现在感染了SARS-CoV的细胞中，p38 MAPK的磷酸化显著上调［30］。而在后来研究中也发现了MAPK中另外两个亚型在感染SARSCoV时也出现磷酸化现象［31］。近期发表的文献指出，COVID-19的发生发展与炎症风暴存在密切关系［32］。炎症风暴即细胞因子风暴，是由感染、药物或某些疾病引起的免疫系统过度激活，呈现高炎症反应状态。一旦发生可迅速引起单器官或多器官功能衰竭，最终威胁生命［33］。IL-6、TNF作为引发新冠肺炎患者炎症风暴中的关键炎症因子，其中IL-6作为一种多效性因子，广泛表达在T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等细胞的表面，是介导炎症和免疫反应的重要因子之一［34］。TNF是促炎性细胞因子，可介导MAPK、ERK、NF-κB 等信号通路广泛参与细胞分化、凋亡和诱发炎症等生理或病理过程［35］。STAT3是信号转导与转录激活子3，可同时介导炎症因子的表达和相应的免疫应答，此外有报道发现STAT3在哮喘模型大鼠的肺组织中高表达［36］。

随后本研究对IL-6、TNF、MAPK3等38个核心靶标进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。从GO的富集结果分析可知，在BP中涉及到3条关于脂多糖（LPS）的GO条目。实验表明LPS可通过下调JAK2/STAT3通路致使肾小球内皮细胞中IL-6、TNF等炎症因子分泌过多，从而导致了炎症反应的发生［37-38］。由KEGG通路富集结果预测六堡茶发挥干预作用是通过干预HIF-1、IL-17、TNF、T细胞受体、Toll样受体、非小细胞肺癌、肺结核、甲型流感等信号通路实现的。其中HIF-1是非常重要的转录调节因子［39］，可通过激活相关靶基因的转录，参与低氧相关的生理或病理过程，如在缺血组织中增加VEGF的表达从而加快血管生成以及参与细胞代谢途径实现细胞适应低氧状态［40］。有研究证明HIF-1与炎症有关，通过涉及免疫反应上调NF-κB信号通路［41］。IL-17由Th17细胞分泌而来，可诱导免疫相关细胞分泌促炎症因子、刺激趋化因子的产生以及通过PTGS2诱导产生前列腺素2等加剧了炎症的发生［42］。IL-17信号通路与NF-κB信号通路存在相互关系，NF-κB是介导炎症和免疫反应的重要调节因子［43］。并且IL-17还可以激活NF-κB、MAPK信号通路。有研究表明MAPK信号通路中，p38MAPK信号通路的活化，加剧了链球菌性肺炎小鼠的炎症［44］。

本研究通过网络药理学结合分子对接的方法对六堡茶干预COVID-19的药效基础、核心靶标、通路进行预测，六堡茶中的核心化学成分（+）-儿茶素、（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯、α-菠甾醇、（-）-儿茶素没食子酸酯、角鲨烯、氯化天竺葵素与SARS-CoV-2 3CL水解酶结合并通过MAPK1、TNF等炎症和免疫相关的靶标介导HIF-1、IL-17、T细胞受体等信号通路发挥干预COVID-19的功效。但是网络药理学研究方法仅起到预测的作用，具有一定局限性，因此本实验选取结合能较低的且在六堡茶中含量较高的（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯进行了SARS-CoV-2 3CL水解酶活力测定，发现（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯对SARSCoV-2 3CL水解酶有一定的抑制效果。现阶段对COVID-19的发生、发展、变异等机制的研究存在着诸多的不确定，故其具体的机制有待进一步的体内外实验研究。