基于网络药理学探究清肺达原颗粒治疗肺炎的药理作用机制

甘大莉，师军凤，杨素琴，向梅先

（中南民族大学药学院,武汉430074）

肺炎是一种常见呼吸道炎症疾病，主要由病毒、细菌感染所致［1-3］，如果治疗不及时，将发展为重症肺炎［4-6］。中医学认为，重症肺炎属“风温肺热病”“肺热病”之范畴，其病情急重，古人称之为“肺气热喘”“喘急”“上气”“肺闭喘咳”等［7-8］，主要表现为呼吸困难、肺部湿啰音、高热和意识障碍等临床症状以及其他严重并发症［9］。对于重症肺炎的病因病机，多数医家认为是正气亏虚、外邪侵袭肺部所致［10］。而新型冠状病毒感染引发的肺炎在危重症阶段，湿热疫毒之邪入里，损伤肺脏，使肺主气、司呼吸的功能失常，发生气道壅滞［11-12］，根据其临床症状可归类于重症肺炎范畴。

清肺达原颗粒是在国医大师梅国强教授的指导下制定的，该方由柴胡陷胸汤合达原饮加减而成，包括柴胡、黄芩、法半夏、党参、全瓜蒌、槟榔、草果、厚朴、知母、芍药、生甘草、陈皮、虎杖，具有和解少阳、化湿解毒的功效，临床上对发热症状的减轻、病情进展的控制以及肺炎并发症的减轻等具有明显疗效［13-14］，但其治疗肺炎的作用机制尚不明确。

由于中药复方具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特点，其作用机制复杂［15］。借鉴并应用中药网络药理学技术和方法，挖掘网络中的关键节点和功能模块研发多分子、多靶点的复方制剂，有助于中医药整体和多途径系统调控的作用及其机制的研究，体现了中医药的整体观［16-17］。

本研究运用中药网络药理学的方法，预测清肺达原颗粒治疗肺炎的药效物质基础以及潜在的分子作用机制，建立“中药材－化学成分－关键靶标－作用通路”之间的网络关系，为后续的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 清肺达原颗粒的有效化学成分筛选

清肺达原颗粒共有13味药：柴胡、黄芩、半夏、党参、瓜蒌、槟榔、草果、厚朴、知母、芍药、甘草、陈皮、虎杖。基于中药整合药理学平台（TCMIP）数据库（http：//www.tcmip.cn/）收录的中药及其化学成分，建立任务列表，在“中药信息设定项”中对上述13味药材的相关活性成分分别进行检索［18］，根据药代动力学相关参数，筛选口服生物利用度（oral bioavailability，OB）大于等于30%和类药性（druglikeness，DL）大于等于0.18的中药成分，同时检索最新文献，补充最新研究中获得的有效活性成分［19］，建立清肺达原颗粒的化学成分数据库。

1.2 靶标筛选

利用TCMIP平台，使用开源软件OpenBabel（http：//openbabel.org/）提取 MACCS（molecular ACCess system）分子指纹特征，同时通过“中药靶点数据库”搜索药方中所有中药材化学成分的相关靶标，选择结果中相似性分数大于等于0.8的靶标作为候选靶标，采用二维结构相似性搜索，同时采用Tanimoto系数定义的相似度计量方法，与FDA上市药物的相似性进行对比打分［20］，并分析全方共有靶标。

TCMIP疾病数据库整合了Drug Bank（http：//www.drugbank.ca/）、TTD（http：//xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp）、OMIM（http：//www.omim.org/）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）等多个数据库，在“疾病靶标数据库”中以“pneumonia”为关键词进行检索，提取肺炎已知的相关治疗靶标。

1.3 靶点相互作用网络构建

TCMIP平台镶嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、In Act、HPRD、MINT、DIP和PDZBase等数据库，对蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）信息具有全面的预测，通过该平台可直接得到“中药材－疾病”靶标之间PPI信息。

运用TCMIP的“中医药网络挖掘”模块，建立清肺达原颗粒潜在靶标与疾病靶标之间的PPI信息，将得到的清肺达原颗粒药物靶点和疾病靶点的交集靶点，导入Cytoscape 3.7.2绘制PPI网络图，并对节点连接度（degree）进行分析，以节点连接度的2倍中位数为卡值，筛选网络中的核心节点（hubs），在构建关键节点子网络的基础上，以连接度、节点紧密度（closeness）和节点介度（betweenness）的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为清肺达原颗粒药物靶点－疾病靶标相互作用网络的关键节点，筛选出核心靶点，为下一步GO富集分析和KEGG信号通路富集分析做准备。

1.4 GO富集分析和KEGG信号通路富集分析

TCMIP平台对KEGG数据库和GO数据库进行了整合，能够直接进行核心靶标的GO富集分析和通路富集分析，得到核心靶标在生物过程、细胞组分和分子功能的相关信息，以及核心靶标参与的关键通路信息，最终将P从小到大排序，取排名前20的靶点的GO分析和KEGG通路分析数据通过Origin 2019软件进行可视化处理。

1.5 清肺达原颗粒“药材－成分－靶点－通路”网络构建

根据上述得到的化学成分、靶点和通路的预测结果，利用TCMIP平台在线的关系网络绘图技术，实现中药与化学成分、中药成分与核心靶标以及核心靶标与关键通路相互作用关系的可视化。得到“中药材－化学成分－关键靶标－作用通路”的多层次网络关联图。

2 结 果

2.1 清肺达原颗粒的化学成分及作用靶标收集

通过对清肺达原颗粒分析，得到的中药材各自的化学成分数量，如表1所示。以生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为筛选条件，通过TCMIP筛选、整理得到活性成分474个，部分化合物为柴胡皂苷C、豆甾醇、黄芩素、黄芩黄酮Ⅰ、β-谷甾醇、黑麦草碱、灌木远志酮A、亚麻酸乙酯、karounidiol 3-o-benzoate、原花青素B1、表儿茶素、（-）-儿茶素、（+）-儿茶素、β-胡萝卜素、新橙皮苷、知母皂苷E、薯蓣皂苷元、芍药苷、山奈酚、甘草酚、甘草香豆素、phaseol、川陈皮素、毒扁豆次碱等；删除重复值，得到全方候选靶标共865个（见表1）。

2.2 清肺达原颗粒治疗肺炎的核心靶标

通过TCMIP平台关联网络挖掘分析，对清肺达原颗粒候选靶标和肺炎进行PPI网络关联，将分析得到的蛋白互作关系数据结果导入Cytoscape 3.7.2软件中，得到可视化的蛋白质相互作用体系网络，结果如图1所示，节点的大小由节点连接度（degree）决定，连接度越大，节点越大，节点间连线表示靶点蛋白间存在潜在的相互作用关系。

通过整合药理学平台，分析得出清肺达原颗粒治疗肺炎的核心靶标48个，包括核因子-κB1（NF-κB1）、核因子-κB2（NF-κB2）、白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、热休克蛋白90α家族A族成员1（HSP90AA1）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK3）、磷脂酸肌醇激酶3（PIK3R）、氨基端激酶（JUN）、半胱天冬蛋白酶-3（CASP3）、环氧合酶（PTGS）等（见图1和图2）。

2.3 清肺达原颗粒治疗肺炎的基因功能分析

基于整合药理学平台对收集的关键靶标进行生物学过程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞成分（cellular component，CC）的GO基因功能分析（见图3～图5）。

Figure 1 Protein-protein interaction(PPI)network of candidate targets for the treatment of pneumonia by Qingfei Dayuan Granules

Figure 2 Key targets for the treatment of pneumonia by Qingfei Dayuan Granules

生物过程分析发现，关键靶标基因主要参与了信号转导、对药物的响应、转运状态、G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联受体信号通路ERK1和ERK2级联的正调控、化学突触传递、磷酸化作用、表皮生长因子受体信号通路、血清素受体信号通路、蛋白质磷酸化、G蛋白偶联受体信号通路、偶联环核苷酸第二信使等。对分子功能分析发现，关键靶标主要参与血清素结合、G蛋白偶联血清素受体活性、神经递质受体活性、酶结合、一氧化氮合酶调节活性、ATP结合、蛋白激酶结合、腺苷酸环化酶结合、药物结合、激酶活性、核苷酸结合、蛋白质异源二聚体活化、蛋白激酶活性、腺苷酸环化酶活性、胰岛素受体底物结合、非跨膜蛋白激酶酪氨酸蛋白激酶活性、蛋白质内容复合物结合、肾上腺素能受体活性等。对细胞成分分析发现，关键靶标基因主要参与了含蛋白复合物、树突、质膜、质膜整体成分、薄膜筏、神经元投射、细胞溶质、小窝、突触后致密膜、核浆、轴突、突触膜、核染色质、质膜细胞质侧的外在成分等。推测清肺达原颗粒治疗肺炎的作用机制可能与信号转导蛋白以及活性酶调节、细胞凋亡的基因表达有关。

Figure 3 GO enrichment analysis of biological progresses of key targets for the treatment of pneumonia by Qingfei Dayuan Granules

Figure 4 GO enrichment analysis of molecular functions of key targets for the treatment of pneumonia by Qingfei Dayuan Granules

Figure 5 GO enrichment analysis of cellular components of key targets for the treatment of pneumonia by Qingfei Dayuan Granules

2.4 清肺达原颗粒治疗肺炎的富集通路分析

清肺达原颗粒治疗肺炎的通路富集分析结果见图6和表2。P排名前20的通路中，主要涉及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路（P＜0.05）、IL-17信号通路（P＜0.05）、T细胞受体信号通路（P＜0.05）、肿瘤坏死因子信号通路（P＜0.05）等与疾病发生相关的通路。

Figure 6 Top 20 metabolic pathways of KEGG enrichment analysis of key targets in Qingfei Dayuan Granules

2.5 清肺达原颗粒治疗肺炎的多维网络关系

采用整合药理学平台构建“中药材－化学成分－关键靶标－作用通路”关系网络图（图7），其中☆节点代表中药材；◇和△节点分表代表化学成分和作用通路；○节点代表关键靶标，其中相同颜色节点代表基因间相互作用的程度越紧密。

Table 2 Information on metabolic pathways involved in key targets of Qingfei Dayuan Granules

分析发现，清肺达原颗粒化学成分的作用靶点分布不同的代谢通路，既有一个分子作用多个通路，又有多个分子作用同一通路，共同发挥调节机体水平的作用，体现了药物多成分、多靶点、多途径治疗肺炎的作用机制。

3 讨 论

肺炎可以由细菌或者病毒等病原体感染导致，若不及时进行干预治疗，易转化为重症肺炎［2，21］，甚至危及生命，其发病的高危人群主要为免疫低下的儿童和老年人［7，22］。有研究表明，对于新冠肺炎患者，老年人患重症的程度高于轻症，且病死率较高［23］。对于重症肺炎的治疗，应早期联合抗感染，同时调节患者免疫力，才能取得较好疗效，而中药具有增强免疫的作用［8，24］。给予单一的药物很难达到较好的预后，中药及其复方作为一种传统的给药形式，遵循中医“辨证施治”的基本原则，按照“君臣佐使”的原则配伍而发挥多成分，多靶点、多通路的治疗效果，在治疗疾病的过程中发挥无可替代的作用［25］。清肺达原颗粒由柴胡陷胸汤与达原饮加减而成，临床常用于治疗发热性、呼吸系统、消化系统以及心血管系统疾病，且疗效确切［26］。

由于肺炎发展为重症肺炎后表现出与新冠肺炎患者相似的临床症状，基于中医异病同治的原则，本研究利用网络药理学方法系统分析了清肺达原颗粒治疗肺炎的分子机制。其中CASP3是细胞凋亡的主要效应因子，Bax和Bcl-2是调节细胞凋亡的主要蛋白。Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，两者的含量高低与调控凋亡密切相关，Bax上调或Bal-2下调，通过激活CASP3的表达，从而促进肺泡上皮细胞的凋亡［27］。MAPK3属于促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族可以诱导产生促炎反应从而导致细胞凋亡［28-29］。TNF-α为重要的炎性因子，是早期反应的促炎因子［30］，可诱导肺内皮细胞活化、粒细胞脱落、白细胞迁移等，从而导致症状加重和病理损伤［31］。前列腺素内过氧化物合成酶（PTGS）是前列腺素合成的关键酶，可促进前列腺素E2的合成，介导发热反应［32］。该酶主要包括PTGS1和PTGS2两种亚型，PTGS1可促进血管收缩以及血管平滑肌细胞的增殖［33］，PTGS2可诱导机体出现红肿热痛的炎症性病理反应，通过抑制PTGS1和PTGS2的活性可达到解热抗炎的作用［34］。因此，清肺达原颗粒可能通过调控以上的关键靶点，针对肺炎临床表现出现乏力，发热的症状，发挥解热、抗炎、调节免疫等多种药理作用。

网络药理学分析的富集通路中，糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路主要是通过激活MAPK、核因子κB（NF-κB）等多条信号通路，促进炎症因子IL-6、IL-1、TNF-α等的表达与释放，从引起炎性反应的发生［35］。此外，该通路还能通过诱导单核细胞趋化蛋白-1表达和激活肾素-血管紧张素系统，导致肾脏损伤［36］。IL-17信号通路和肿瘤坏死因子信号通路与抗炎、免疫调节相关［37］，可通过调控促炎因子、趋化因子等的产生和释放，起到间接调控机体免疫系统的作用，在多种自身免疫性疾病和炎性反应过程中发挥重要的作用。T细胞受体信号通路是与免疫反应有关的通路，T细胞可有效清除入侵的病原体和发生感染的细胞，在对抗感染的适应性免疫反应中起关键作用［38］。

本研究运用网络药理学的方法，对清肺达原颗粒进行分析，从13味中药中筛选出NF-κB、TNF、MAPK3、IL-1β、PTGS、CASP3等作用靶标，以及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、T细胞受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等与疾病发生相关的通路。通过调控上述靶点和信号通路，以及通过解热、抗炎和调节免疫功能等途径，从而达到治疗重症肺炎的作用，从分子层面阐述了其潜在的作用机制。本研究基于网络大数据得到的预测，由于其局限性，研究结果还需要通过动物体内实验和细胞体外实验进一步验证。