重组小鼠白介素-33对小鼠实体瘤的抑制作用

蒋丽娅，罗 平，邓少荣，叶 浩，俞 雁，韩 伟*

（1上海交通大学药学院，再生组学实验室，上海200240；2上海交通大学农业与生物学院，上海市兽医生物技术重点实验室，上海 200240）

白介素-33（IL-33）是2003年首次在人高内皮小静脉中发现的核细胞因子，属于IL-1家族成员，表达于内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞等细胞［1］。IL-33受体为IL1RL1基因编码的ST2，在肥大细胞、ILC2s和 Tregs上组成型表达［1-2］。早期发现IL-33/ST2通路与过敏和炎症有关，但近年来越来越多的研究发现IL-33/ST2通路在肿瘤发展中也有重要的作用。有研究发现，肝癌患者肿瘤组织中的IL-33水平显著低于正常人［3］，但另有报道称肝癌患者组织和血清中的IL-33水平显著增高［4］。然而肝小叶接种过表达IL-33的Hepa 1-6肝癌细胞或质粒发现肿瘤质量和数目均显著低于对照组，初步显示IL-33对肝癌可能具有抑制作用［5］。有研究表明肺癌患者血清中IL-33显著高于正常人血清中的IL-33含量［6］，但是在LLC肺转移模型中，转IL-33基因过表达的小鼠生存率显著高于对照组，提示IL-33或许可抑制肺癌生长［7］。Deng等［8］发现过表达锌指蛋白36（tristetraprolin）能降低IL-33水平，从而抑制胃癌生长。另有研究发现胃癌生长必需的炎症细胞因子IL-11刺激肿瘤上皮细胞，使其产生IL-33，从而激活肥大细胞，并促进胃癌的生长［9］。这个结果提示IL-33与胃癌的生长有关，但外源性IL-33对胃癌生长的影响还未见报道。先前研究发现IL-33在肿瘤中的低表达是一种与复发性前列腺癌和肾透明细胞癌相关的免疫生物标志物。在mRNA水平上，良性前列腺癌IL-33表达最多，初发性肿瘤次之，转移性前列腺癌最少，表明IL-33与疾病发展进程呈负相关；同时发现其与疾病预后也呈负相关，即IL-33表达越低，前列腺癌预后越差［10］：这提示IL-33可能抑制前列腺癌发展。在结肠癌小鼠模型中，IL-33诱导肿瘤微环境中ST2L＋调节T细胞（ST2L+Treg）的增加或招募CD11b+GR1+、CD11b+F4/80+骨髓细胞，进而促进结肠癌生长或肝转移［11-12］。然而，另有研究发现内源性IL-33对结肠癌具有抑制作用［13］、阻断IL-33/ST2通路可显著促进结肠癌发展［14］以及ST2缺失导致结肠癌细胞中Treg细胞浸润增多［15］，表明IL-33/ST2通路能抑制结肠癌发展。目前IL-33对于结肠癌生长的影响仍有争议，且关于IL-33给药时间与给药时长对于结肠癌影响的研究也未见报道。

本课题组前期已证明了重组小鼠白介素-33（mIL-33）可显著激活小鼠体内的抗肿瘤免疫系统，并有效抑制肿瘤生长［16］。在此基础上，本研究进一步探讨mIL-33在不同类型肿瘤中的抑瘤作用，为后续临床治疗提供科学依据。

1 材料

1.1 试剂

mIL-33由上海交通大学药学院再生组学实验室构建纯化得到，纯化后的mIL-33蛋白纯度大于95%，内毒素水平小于 0.1 EU/μg［16］；DPBS（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline）、胎 牛 血 清（FBS）、青霉素链霉素双抗、RPMI 1640和DMEM培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；胰酶（北京索莱宝科技有限公司）；CCK-8试剂盒（上海东仁化学科技有限公司）。

1.2 仪器

L500台式低速自动平衡离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；TS100倒置显微镜（日本Nikon公司）；多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.3 细胞株和动物

Hepa1-6小鼠肝癌细胞和RM-1小鼠前列腺癌细胞购于中国科学院细胞库；MFC小鼠胃癌细胞、LLC小鼠肺癌细胞和CT26小鼠结肠癌细胞来源于美国菌种保藏中心。

BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠来自于上海杰思捷实验动物有限公司（合格证号：SCXK（沪）2018-0004），采用6～8周龄的雄性小鼠，并得到上海交通大学动物伦理委员会批准。

2 方法

2.1 肿瘤细胞的培养

本实验所使用的肿瘤细胞均贴壁生长。其中Hepa1-6细胞和LLC细胞用含10%FBS的DMEM培养基进行培养；RM-1细胞、MFC细胞和CT26细胞用含10%FBS的RPMI 1640培养基进行培养。培养方法同文献［17］一致。

2.2 肿瘤模型的构建

在皮下荷瘤模型中，所有肿瘤细胞均接种于小鼠的右侧腋下皮下，其中Hepa1-6细胞（4×106个）、LLC细胞（4×106个）或RM-1细胞（2×106个）分别接种于C57BL/6J小鼠皮下；MFC细胞（4×106个）和CT26结肠癌细胞（1×106个）分别接种于BALB/c小鼠皮下。待肿瘤生长至30 mm3大小左右，将小鼠随机分成4组。从肿瘤可见起，每隔1天使用游标卡尺测量一次小鼠肿瘤的长度（L）和宽度（W），使用小鼠肿瘤体积计算公式V=（L×W2）/2计算肿瘤体积，并在检测终点采用颈椎脱臼法处死小鼠后，剥取肿瘤组织称重。

2.3 给药方法

mIL-33用DPBS稀释，待肿瘤生长至30 mm3左右（即肿瘤细胞接种后第5天）开始皮下给药，每天1次。注射DPBS为对照组。

2.4 mIL-33的体外药效实验

待Hepa1-6、LLC、MFC与RM-1细胞生长至对数期后，消化细胞，用5%FBS的培养基将细胞稀释至每毫升2.5×104个。每孔100 μL，接种于96孔板中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h后，弃培养上清液。分别加入含0、0.012、0.037、0.11、0.33、1、3 μg/mL质量浓度mIL-33的5%FBS培养基100 μL。每个梯度3～5个复孔。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h，按照CCK-8试剂盒说明书进行检测。在酶标仪上，以450 nm为主波长，655 nm为参比波长读数。计算公式：细胞存活率（%）=［（试验孔吸收度-空白孔吸收度）/（对照孔吸收度-空白孔吸收度）］×100。

2.5 数据分析

3 结 果

3.1 mIL-33对Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的抑制作用

在Hepa1-6肝癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33给药组（10，30和90 μg/kg）肿瘤体积均极显著小于溶剂对照（DPBS）组；且给药组中，90 μg/kg组的肿瘤体积也分别显著小于10 μg/kg组和30 μg/kg组（图1）。这些结果表明，mIL-33可显著抑制Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠模型中肿瘤的生长，且随着剂量增高，肿瘤生长呈逐渐降低的趋势。

Figure 1 Inhibitory effect of mIL-33 on tumor growth in Hepa1-6 subcutaneous tumor model in C57BL/6 mice(-x±sx,n=6)Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS)group was the solvent control group

3.2 mIL-33对LLC肺癌荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的影响

在LLC肺癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33给药组（10，30和90 μg/kg）肿瘤体积和质量均显著小于DPBS组（图2）。且给药组中，30 μg/kg组的肿瘤体积和质量均显著高于90 μg/kg组，但均显著低于10 μg/kg组（图2）。这些结果表明，mIL-33显著抑制LLC肺癌荷瘤小鼠模型中肿瘤的生长，且随着剂量的增高，肿瘤生长呈显著降低的趋势。

Figure 2 Inhibitory effect of mIL-33 on tumor volume（A）and tumor weight（B）in LLC subcutan-eous tumor model in C57BL/6 mice.Mice were sacrificed on day 21 after tumor inoculation，and tumors were dissected and weighed for comparison(x± sx,n=8-10)

3.3 mIL-33对MFC胃癌荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的抑制作用

在MFC胃癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33给药组（10，30和 90 μg/kg）肿瘤体积均显著小于DPBS组（图3）。在给药组中，10、30和90 μg/kg组小鼠肿瘤体积在治疗后第5天开始变小，而溶剂对照组肿瘤体积呈增加趋势（图3）。上述结果表明，mIL-33显著抑制MFC胃癌荷瘤小鼠模型中肿瘤的生长，且在较低的给药剂量（10 μg/kg）就具有较好的抑制作用。

3.4 mIL-33对RM-1前列腺癌荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的影响

Figure 3 Inhibitory effect of mIL-33 on tumor growth in MFC subcutaneous tumor model in BALB/c mice(-x±sx,n=9)

在RM-1前列腺癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33给药组（90 μg/kg）肿瘤体积和质量均显著小于DPBS组与 mIL-33给药组（10，30 μg/kg）。然而，DPBS组和mIL-33给药组（10，30 μg/kg）之间的肿瘤体积和质量均无显著性差异（图4），表明mIL-33显著抑制RM-1前列腺癌荷瘤小鼠模型中肿瘤的生长，但可能需要较高的剂量（90 μg/kg）才能发挥抑瘤作用。

3.5 等剂量mIL-33在不同给药时长下对CT26结肠癌荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的影响

在CT26结肠癌皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33给药组均于肿瘤细胞接种后第5天（d 5）开始皮下注射 360 μg/kg mIL-33，给药时长分别为3 d（d 5-d 7）、6 d（d 5-d 10）和9 d（d 5-d 13），每天 1次。从图5可知，mIL-33给药组（给药3 d、6 d）的肿瘤体积和质量分别显著小于DPBS组，但均分别显著高于mIL-33给药组（给药9 d）。且给药组中，给药3 d组和给药6 d组的肿瘤体积和质量均无显著性差异（图5）。实验结果表明mIL-33可显著抑制CT26结肠癌荷瘤小鼠模型中肿瘤的生长，mIL-33给药3 d和给药6 d对于肿瘤抑制效果无显著差异，但延长给药至9 d时对肿瘤的抑制作用则显著增加。进一步提示mIL-33能较快地能激活抗肿瘤免疫应答，但其作用强度可能具有时效关系，即持续刺激肿瘤免疫一定时间后，其抗肿瘤应答能显著增强。

3.6 等剂量mIL-33在不同给药时期下对CT26结肠癌荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的影响

在CT26皮下荷瘤模型中，mIL-33给药组分别于肿瘤细胞接种后第5天（d 5）、第10天（d 10）和第15天（d 15）开始皮下注射90 μg/kg mIL-33，每组给药时长均为9 d（d 5-d 13、d 10-d 18和d 15-d 23），每天1次。mIL-33给药组（d 10-d 18）肿瘤体积显著小于DPBS组，但显著高于mIL-33给药组（d 5-d 13）（图6）。且给药组中，d 15-d 23组在给药后肿瘤生长迅速减缓，并于第21天开始肿瘤生长趋势与d 5-d 13组基本一致，提示这两种给药方案对肿瘤生长的最终影响较为一致（图6）。此外，d 15-d 23组与d 10-d 18组的肿瘤体积无显著性差异，但有降低的趋势（图6）。这些结果表明mIL-33抑制CT26结肠癌荷瘤小鼠模型中肿瘤生长的作用与起始给药时间有一定关联，似乎在肿瘤发展较“早期”（d 5）与较“后期”（d 15）给药mIL-33能有效且持续地激活抗肿瘤免疫应答，而在肿瘤发展“中期”给药mIL-33不能有效地增强机体的抗肿瘤免疫（尤其在d 10-d 15期间）。本实验室先前研究发现细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤接种2周时的增殖能力和分泌IFN γ的量达到峰值［18］。因此，此阶段机体内具有较强的抗肿瘤免疫应答，额外给予mIL-33可能难以起到增效的作用。

3.7 mIL-33在体外对Hepa1-6、LLC、MFC与RM-1细胞增殖的影响

前期研究了外源性mIL-33在小鼠体内对肿瘤生长的影响，但其在体外是否直接对肿瘤细胞造成杀伤有待进一步研究。如图7所示，与对照组相比，mIL-33在不同质量浓度梯度下对Hepa1-6、LLC、MFC和RM-1细胞存活率均无显著影响，且这些细胞的存活率随着mIL-33质量浓度的增加也无显著变化。因此，mIL-33在体外不能直接抑制Hepa1-6、LLC、MFC与RM-1细胞的生长，提示mIL-33可能通过免疫细胞发挥抑制肿瘤生长作用。

4 讨 论

本研究发现外源性mIL-33显著抑制小鼠肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌和前列腺癌的生长，但在不同的肿瘤模型中，mIL-33的量效关系有一定差别。另外，本实验还发现外源性mIL-33不能在体外抑制Hepa1-6肝癌细胞、LLC肺癌细胞、MFC胃癌细胞和RM-1前列腺癌细胞的生长，提示其不能直接对肿瘤细胞造成杀伤，而可能通过体内免疫细胞或分子通路发挥抗肿瘤作用。

本研究发现外源性注射mIL-33也能有效地抑制Hepa1-6肝癌、LLC肺癌和CT26结肠癌的生长，与文献［5，7，15］报道一致。然而另有报道称阻断mIL-33可抑制免疫缺陷小鼠体内非小细胞肺癌的生长［19］、体内过表达IL-33促进非小细胞肺癌的生长和转移［20］、IL-33可通过改变肿瘤内环境来促进结肠癌发生与肝转移［12，21］。在MFC胃癌小鼠模型中，锌指蛋白36通过抑制IL-33途径来限制胃癌的发展［8］，且肿瘤来源的IL-33维持肥大细胞和巨噬细胞依赖性信号级联，是胃癌生长所必需的重要因子［9］。与此相反，本研究发现外源性注射mIL-33显著抑制小鼠体内MFC胃癌的生长，提示IL-33可能是一个颇有前景的治疗胃癌新靶点。

Figure 7 Effect of different concentrations of mIL-33 on the proliferation of Hepa1-6 liver cancer cells（A，n=5），LLC lung cancer cells（B，n=4），MFC gastric cancer cells（C，n=5）and RM-1 prostate cancer cells（D，n=5）in vitro

目前关于IL-33对肿瘤生长的作用仍存在争议，促肿瘤生长和抑制肿瘤生长均有相关报道，其中可能涉及多种因素影响。有研究发现不同细胞来源的IL-33对肿瘤的生长具有完全不同的作用。肿瘤上皮细胞表达的IL-33会增加其免疫原性，通过CD8+T细胞和NK细胞促进1型抗肿瘤免疫反应，从而抑制肿瘤生长；而肿瘤基质和血清中表达的IL-33能通过Treg细胞和骨髓来源的抑制细胞来增强免疫抑制，从而促进肿瘤生长［22］。也有报道称IL-33的不同作用取决于不同免疫细胞中的IL-33/ST2信号传导。因为IL-33既可以激活促进肿瘤生长的细胞，如肥大细胞、Treg细胞等，又可以激活抑制肿瘤发展的细胞，如NK细胞、CD8+T细胞等，最终促进或者抑制肿瘤生长取决于哪种作用更强［23］。从本研究来看，IL-33对肿瘤的作用强度和肿瘤类型、给药剂量以及给药时期密切相关，不同情况下可能具有完全不一样的效果。因此，推测不同研究IL-33的方式（过表达IL-33、敲除IL-33或外源注射IL-33蛋白）、肿瘤模型以及给药时期可能会对IL-33在肿瘤中扮演角色的判断造成较大干扰，后续的研究应充分考虑这些因素所带来的影响。

综上，本研究发现外源性mIL-33显著抑制小鼠肝癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和结肠癌的生长，较详细地研究了相关的量效或时效关系。尽管IL-33在这些肿瘤中的抗肿瘤作用机制尚未完全揭示，但本研究的结果充分表明IL-33在治疗各类肿瘤中具有良好的应用前景。