血清淀粉样蛋白A 对小胶质细胞迁移的影响及机制研究

林爱花，刘 锦，陈岩青，张 岩，于 洋*

（1上海交通大学药学院，上海200240；2上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所，癌基因与相关基因国家重点实验室，上海200240）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种典型的中枢神经系统退行性疾病。脑内细胞外聚集的老年斑（以β amyloid，即Aβ为主要成分）和细胞内聚集的神经纤维缠结（主要由过度磷酸化的Tau蛋白构成）是AD的两大病理特征［1-2］。近年来，不断增加的研究数据表明，脑内的炎症反应也参与了AD的整个病理进程［3-4］。小胶质细胞在中枢神经系统中发挥重要免疫作用。在AD患者脑内，小胶质细胞迁移并募集在Aβ斑块周围，发挥免疫功能［5］。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）被认为是主要的急性期反应蛋白。当机体被感染和受到伤害时，其在外周血浆中的浓度可增加1 000倍［6］。SAA具有细胞因子样特性，参与着机体的各种炎症反应［7-8］。SAA的免疫功能在外周系统研究较多，但在脑内研究较少。因此，为探究SAA是否参与小胶质细胞在AD中的免疫反应，本研究探索了SAA对小胶质细胞迁移的影响及其作用机制，为AD治疗及预防提供理论依据。

1 材料

1.1 试剂

鼠源小胶质细胞系N9（上海生物科学研究院）；Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）培养基、Iscove's modified Dulbecco's medium（IMDM）培养基、胰酶、胎牛血清（美国Gibco公司）；脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）（来 源Escherichia coli0111：B4）、WRW4肽、TLR2中和抗体、多聚赖氨酸、ERK抑制剂PD98059、p38抑制剂SB203580、JNK 抑制剂 SP600125、NF-κB 抑制剂SN50（美国Sigma公司）；重组人apo-SAA蛋白（美国PeproTech公司）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒、实时荧光PCR试剂（日本东洋纺公司）；Transwell小室、Falcon®40 μm细胞过滤网（美国Corning公司）；结晶紫粉末（上海生工生物技术有限公司）；RIPA细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）；Western blot第二抗体IRDye®800CW、IMDye®800CW（美国LI-COR公司）；Western blot所需第一抗体如表1所示。其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

解剖镜（Olympus SZX7，日本奥林巴斯公司）；实时荧光定量PCR仪器（美国ABI公司）；蛋白免疫印迹电泳系统（美国Bio-Rad公司）；Odyssey P140-CLx红外荧光扫描成像系统（美国Gene公司）。

Table 1 Primary antibodies used in Western blot

2 方 法

2.1 小鼠原代小胶质细胞分离及培养和鼠源N9小胶质细胞培养

原代小胶质细胞分离及培养方法参考文献报道［9］，取新生1天（不超过24 h）的野生型小鼠，去掉脑壳、中脑、嗅球，去除包裹皮层的膜与胼胝体等。随后将皮层组织尽量剪碎，胰酶进行消化处理后，加入含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸链霉素的DMEM培养基平铺在多聚赖氨酸包被的75 cm2的细胞培养瓶中放入培养箱培养。第1天和第3天时分别更换新的DMEM培养基。至第7天，将培养瓶放入摇床中，以260 r/min转速在37℃持续摇动2.5 h后离心即得小胶质细胞。N9小胶质细胞采用含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸链霉素的IMDM培养基进行常规培养。

2.2 Transwell小室检测细胞迁移能力

取孔径8 μm的小室，在下室加入各组溶液600 μL。收集原代小胶质细胞和对数生长期的N9小胶质细胞，用纯培养基稀释为每毫升5×105个的密度，添加200 μL到上室。对于抑制剂或中和抗体预孵育的实验，上室细胞提前用配好的抑制剂或中和抗体溶液预孵育细胞15 min再用含有抑制剂或中和抗体的培养基溶液稀释到所需密度。FPR2受体拮抗剂WRW4使用质量浓度为1，5，10 μmol/L；TLR2中和抗体Anti-mTLR2-IgG使用浓度为 0.1，0.5，1 μg/mL。ERK 抑制剂 PD98059、p38抑制剂SB203580和JNK抑制剂SP600125使用浓度均为20 μmol/L；NF-κB抑制剂SN50使用浓度为10 μmol/L。原代小胶质细胞放入培养箱培养12 h，N9小胶质细胞培养6 h后取出小室。PBS溶液洗涤，浸泡于甲醇溶液15 min，随后用结晶紫染色30 min。用PBS清洗膜，擦除膜上层细胞。进行了3次独立实验，每个样本取3个视野在显微镜下进行观察和拍照。

2.3 实时荧光定量PCR检测FPR2和TLR2的mRNA表达

用1 μmol/L SAA刺激N9小胶质细胞1，3，6，9和12 h。Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA和qRT-PCR反应具体操作均按照说明书进行。PCR条件设定为预变性94℃3 min，94℃30 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40个循环，接着再72℃10 min。 基因 表达 的结 果计 算 采用 2-ΔΔCt法 ，以GAPDH的mRNA表达作为内参。基因的引物序列如表2所示。

Table 2 Primer sequences used for qRT-PCR

2.4 Western blot检测MAPKs和NF-κB信号通路激酶表达

用1 μmol/L SAA刺激N9小胶质细胞1，5，15，30，60 min后，收集各组细胞，然后采用RIPA裂解细胞。用10%浓度凝胶进行蛋白质电泳，电泳结束后使用NC膜进行转膜，5%脱脂奶粉在室温条件进行1 h封闭，分别加入一抗溶液（p-ERK1/2、ERK、p-p38、p38、p-JNK、JNK、IkBα和GAPDH），稀释比例均为1∶1 000，4℃孵育过夜。第2天采用TBST漂洗，加入对应二抗溶液（IRDye®800CW和IMDye®800CW），避光于摇床上室温孵育1 h。洗膜后使用红外荧光扫描成像系统曝光及保存图片。进行了两次独立实验。

2.5 统计学分析

使用ImageJ Launcher对拍摄的图片进行分析和定量；使用GraphPad Prism 6软件统计数据。数据统计结果为-x±s，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 SAA诱导原代小胶质细胞和N9小胶质细胞迁移

采用Transwell检测SAA对原代小胶质细胞和N9小胶质细胞迁移能力影响。结果显示，SAA以浓度依赖性方式促进原代小胶质细胞和N9小胶质细胞的迁移，1 μmol/L SAA的作用效果最强，组间差异具有统计学意义。因为重组蛋白SAA含有微量LPS（小于1.2 ng/mL），因此为排除SAA内LPS的干扰，本研究设计了高于此剂量的LPS（2.5 ng/mL）作为对照组。结果显示此剂量的LPS对小胶质细胞的迁移并没有影响（图1），说明SAA对小胶质细胞的迁移作用并没有LPS的参与。

Figure 1 Serum amyloid A(SAA)induces migration of primary microglia and N9 microglia(-x ± s,n=9）A:Primary cultures of microglia and N9 microglia was treated with SAA(0.1-1 μmol/L)or LPS(2.5 ng/mL),and the migration was detected by Transwell assay;B:Quantitative analysis of SAA-induced migration of primary microglia;C:Quantitative analysis of SAA-induced migration of N9 microglia

3.2 FPR2受体拮抗剂和TLR2中和抗体抑制了SAA诱导的N9小胶质细胞迁移

因为FPR2和TLR2是SAA的两个主要受体，为验证SAA诱导小胶质细胞的迁移是否通过这两个受体，本研究加入FPR2受体拮抗剂WRW4和TLR2中和抗体检测SAA对N9小胶质细胞迁移能力影响。结果发现1，5，10 μmol/L的WRW4均能抑制SAA诱导的N9小胶质细胞迁移（图2-A，B）。TLR2中和抗体也以浓度依赖性方式抑制SAA诱导的N9小胶质细胞迁移，1 μg/mL SAA的作用效果最强（图2-C，D）。组间差异有统计学意义。此结果说明SAA通过作用FPR2和TLR2这两种受体诱导小胶质细胞的迁移。

3.3 SAA诱导N9小胶质细胞FPR2和TLR2受体转录水平增加

此外，本研究进一步检测SAA是否对这两种受体的表达有影响。使用实时荧光定量PCR方法检测SAA对N9小胶质细胞FPR2和TLR2受体mRNA表达的影响。结果发现SAA能够显著诱导N9小胶质细胞FPR2和TLR2 mRNA转录水平的增加，特别是FPR2受体。SAA诱导FPR2受体转录水平呈渐进式的升高，在9 h达到顶点，增加了约70倍（图3）。而SAA对TLR2的表达诱导呈山峰状，在6 h达到峰值，增加了约12倍（图3）。LPS也诱导了这两个受体转录水平微量的增加，但增加的程度远小于SAA的作用，特别是对于FPR2受体（图3）。这个结果说明SAA能够显著诱导小胶质细胞FPR2和TLR2受体的表达，且对FPR2受体表达的诱导作用更强。

3.4 SAA激活N9小胶质细胞MAPKs和NF-κB信号通路

因为FPR2和TLR2受体激活能够诱导下游丝裂原激活的蛋白激酶（MAPKs）和核因子κB（NF-κB）信号通路变化，因此采用Western blot检测SAA对N9小胶质细胞MAPKs和NF-κB信号通路的影响。结果发现SAA能够显著增加细胞外信号调节激酶（ERK）、p38和c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化水平，降低IĸBα表达水平，并且在15 min作用最明显（图4）。这个结果说明SAA能够激活N9小胶质细胞下游MAPKs和NF-κB信号通路。

Figure 2 FPR2 antagonist and TLR2 neutralizing antibody inhibit SAA-induced migration of N9 microglia(-x ± s,n=9）A,B:Effect of FPR2 antagonist(WRW4)on SAA-induced migration of N9 microglia was detected by Transwell assay.(a)Control;(b)1 μmol/L SAA;(c)1 μmol/L WRW4+1 μmol/L SAA;(d)5 μmol/L WRW4+1 μmol/L SAA;(e)10 μmol/L WRW4+1 μmol/L SAA;(f)10 μmol/L WRW4;(g)2.5 ng/mL LPS;(h)10 μmol/L WRW4+2.5 ng/mL LPS.C,D:Effect of TLR2 neutralizing antibody on SAA-induced migration of N9 microglia was detected by Transwell assay.(a)Control;(b)1 μmol/L SAA;(c)0.1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+1 μmol/L SAA;(d)0.5 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+1 μmol/L SAA;(e)1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+1 μmol/L SAA;(f)1 μg/mL IgG+1 μmol/L SAA;(g)1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG;(h)2.5 ng/mL LPS;(i)1 μg/mL Anti-mTLR2-IgG+2.5 ng/mL LPS.

Figure 3 SAA increases the mRNA levels of FPR2(A)and TLR2(B)in N9 microglia(-x ± s,n=4）

3.5 p38、JNK及NF-κB信号通路参与了SAA诱导的N9小胶质细胞迁移

Figure 4 SAA activates MAPKs and NF-κB signaling pathways in N9 microglia(-x ± s,n=2)A:Effect of SAA on the phosphorylation levels of MAPKs and NF-κB signaling pathway kinases in N9 microglia was examined by Western blot;B:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the phosphorylation of ERK;C:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the phosphorylation of p38;D:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the phosphorylation of JNK;E:Quantitative analysis of SAA-induced changes in the expression of IĸBα

为验证SAA诱导小胶质细胞的迁移是否通过MAPKs和NF-κB信号通路，采用MAPKs和NF-κB信号通路抑制剂检测SAA对N9小胶质细胞迁移能力影响。结果发现ERK抑制剂PD98059不能有效抑制SAA诱导的N9小胶质细胞迁移。而p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125及NF-κB抑制剂SN50均可以显著抑制SAA诱导的N9小胶质细胞迁移（图5）。组间差异有统计学意义。此结果说明SAA通过激活p38、JNK及NF-κB信号通路诱导小胶质细胞的迁移。

Figure 5 Inhibitor of p38，JNK，or NF-κB inhibits SAA-induced migration of N9 microglia(-x ± s,n=9）A,B:Effect of inhibitors of MAPKs(ERK,p38,and JNK)and NF-κB on SAA-induced migration of N9 microglia was detected by Transwell assay.(a)Control group;(b)1 μmol/L SAA;(c)20 μmol/L PD98059+1 μmol/L SAA;(d)20 μmol/L SB203580+1 μmol/L SAA;(e)20 μmol/L SP600125+1 μmol/L SAA;(f)10 μmol/L SN50+1 μmol/L SAA;(g)20 μmol/L PD98059;(h)20 μmol/L SB203580;(i)20 μmol/L SP600125;(j)10 μmol/L SN50

4 讨论

外周血液循环中的血清淀粉样蛋白A主要是由急性期反应中的肝细胞合成的，而在肝外产生的SAA被认为与包括AD在内的慢性炎症疾病更为相关［10］。然而，目前关于SAA在中枢神经系统及神经胶质细胞中的作用研究较少。本研究中，采用重组蛋白SAA作用小胶质细胞，证明SAA能够通过FPR2、TLR2受体，激活MAPK和NF-κB信号通路，进而促进小胶质细胞的迁移。这些结果为SAA在中枢神经系统炎症性疾病中的作用提供了新的证据。

有研究报道AD患者脑脊液中SAA的浓度显著高于正常对照组［11］。免疫组织化学方法检测结果表明SAA与Aβ斑块共定位［12］。而且，SAA转基因小鼠在诱导全身性急性期反应后增加了淀粉样蛋白的沉积［13］。最近有研究表明，SAA和AD小鼠记忆衰退有关［14-15］。本实验室前期研究表明，SAA刺激能够激活原代小胶质细胞，剂量依赖性地增强小胶质细胞的增殖能力，抑制小胶质细胞凋亡［9］。小胶质细胞在中枢免疫反应中发挥重要作用。在AD患者脑内，小胶质细胞通过迁移围绕在Aβ斑块附近，发挥免疫反应，吞噬和释放炎症因子等［5］。然而，并没有研究报道SAA对胶质细胞迁移的影响。因此，本研究中首先探究了SAA是否影响小胶质细胞的迁移能力。结果发现，SAA能够以浓度依赖性方式促进原代小胶质细胞和N9小胶质细胞迁移（图1）。之前的研究显示SAA具有趋化因子特性。SAA对人单核细胞、中性粒细胞、未成熟树突状细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和滑膜成纤维细胞有明显的趋化作用［16］。并且，小鼠皮下注射SAA可诱导中性粒细胞和单核细胞显著募集到注射部位，表明SAA趋化特性［17］。本研究的结果首次表明，SAA对脑内的小胶质细胞也具有趋化迁移的作用。

研究表明SAA可以与多种受体结合，产生相应的生物学功能。对于中性粒细胞，SAA可以结合其细胞表面的FPR2和TLR2受体，进而激活细胞内的 MAPKs、PI3K 和 NF-κB 等信号通路［18-19］。例如，SAA通过结合FPR2可以促进中性粒细胞迁移，也可以增加趋化因子表达进而结合TLR2受体协同增强诱导白细胞迁移的能力［20］。因此，采用这两种受体的拮抗剂和/或中和抗体，发现它们均能有效抑制SAA诱导的N9小胶质细胞的迁移。这些结果表明SAA通过FPR2和TLR2受体促进小胶质细胞迁移。此外，本研究还验证了SAA对N9小胶质细胞FPR2和TLR2受体表达，即其mRNA转录水平的影响。结果发现SAA能够促进N9小胶质细胞内这两种受体mRNA转录水平的增加（图3）。本课题组之前的研究也表明SAA能诱导原代小胶质细胞这两种受体转录水平的增加［9］，提示SAA还能够通过诱导这两种受体表达增加，进一步增强其对小胶质细胞迁移的促进作用。

此外，本研究还检测了SAA对N9小胶质细胞内MAPKs和NF-κB信号通路的影响。已有研究报道细胞迁移与MAPKs和NF-κB通路的激活密切相关。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和产促红细胞生成素肝细胞受体结合蛋白（erythropoietin-producing hepatocellular receptor interacting protein B1，ePhin B1）诱导的细胞迁移与JNK信号通路活化密切相关［21-22］。p38的特异性抑制剂SB203580和SB202190能够有效抑制由血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转 化 生 长 因 子 β（transforming growth factor β，TGFβ）和白介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）诱导的平滑肌细胞迁移［23］。ERK通路抑制剂PD98059和U0126则可抑制细胞基质蛋白对不同类型细胞的迁移［21］。NF-κB对于激活素诱导的大肠癌细胞迁移至关重要［24］。本研究结果发现SAA能够激活N9小胶质细胞内MAPKs（ERK、p38和JNK）和NF-κB信号通路，表明SAA可能通过这些信号通路诱导小胶质细胞迁移。进一步的实验发现，p38、JNK及NF-κB信号通路抑制剂能够显著抑制SAA诱导的N9小胶质细胞迁移，提示SAA通过激活这些信号通路诱导小胶质细胞的迁移。未来的研究中，将通过体内动物实验，探究SAA如何通过影响小胶质细胞迁移参与AD的病理进程。此外，有研究表明MAPKs和NF-κB信号通路的激活能够诱导FPR2和/或 TLR2 受体表达上调［25-26］。因此，SAA诱导这两种受体表达增加可能与其激活的下游MAPKs和NF-κB信号通路有关，但具体的相关机制还需要进一步的实验验证。

综上所述，本研究首次发现SAA能够促进小胶质细胞的迁移，其机制是通过作用于其细胞表面的FPR2和TLR2受体，激活下游的MAPKs和NF-κB信号通路。SAA还通过增加这两种受体的表达，进一步促进小胶质细胞迁移。本课题组之前的研究发现，SAA刺激小胶质细胞释放的白介素 10（interleukin-10，IL-10）能够降低原代培养神经元由于LPS引起的Tau蛋白过度磷酸化［27］。这些研究结果表明SAA可以通过调节小胶质细胞参与AD中的神经炎症反应，提示SAA可作为AD治疗和预防的一个重要的潜在靶点。