影响猪体细胞核移植的因素

于延淼 辽宁省铁岭市昌图县畜产品质量安全监测站 112500

1 供体细胞

1.1 供体细胞的来源

多种组织来源的体细胞如乳房上皮细胞、各种成纤维细胞、卵丘/颗粒细胞、输卵管上皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、睾丸支持细胞和神经细胞等都可以用于克隆动物，但来源于不同组织或细胞种类的细胞的重编程能力和核移植效率明显不同。有些种类的供核细胞虽然能够得到克隆囊胚，但是没有获得克隆后代。

1.2 供体动物年龄

多数研究表明，在核移植过程中，采用来源于胚胎和新生动物的细胞作为供核细胞，其克隆胚胎具有相似的囊胚发育率，但是胎儿细胞却更容易得到健康的新生动物。这可能是由于胎儿细胞的分化程度较低，在重组胚中更容易启动重编程。而成体动物由于年龄较大，体细胞分化程度较高，积累了较多的损伤和突变，因此导致重组胚胎发育能力降低。但是也有研究认为，体细胞克隆胚胎的发育率与供体细胞动物的年龄无关。采用传代早期的细胞，似乎更有利于核移胚的发育。

1.3 供核细胞的细胞周期

当核供体进入MⅡ期卵母细胞质后经过激活，会发生移入核的核膜崩解（NEBD）、染色体超前浓缩（PCC）、核仁分散、核膜重新出现和类原核的形成（PN）以及原核膨大等一系列形态学变化。

2 受体细胞

2.1 卵母细胞的选择

猪卵母细胞体外成熟培养及体外发育能力与成熟液和培养条件有密切的联系。现在普遍用两种基本的成熟培养基础液NCSU-23和TCM 199。一般有两种培养条件，其一为38.5℃、5%的CO2和95%的空气，其二为38.5℃、5%的CO2、5%的O2和90%的N2。选择合适卵龄的成熟卵母细胞作为胞质受体对核移植有很大的影响。

2.2 卵母细胞去核

卵母细胞快速而准确地去核可避免孤雌发育，缩短体外操作时间，减少实验中的干扰因素。通常有以下几种方法：活性荧光染料定位法、盲吸法、点压法、化学诱导去核法及纺锤体探测技术。

2.3 卵母细胞注核

注核一般分为胞质内注射和透明带下注射。胞质内注射一般用Piezo－actuation（压电-陶瓷系统）微注射系统，直接把供体核注入胞质内；透明带下注射则把整个供核细胞注射至卵周隙，并需要融合。当然，Peura等采用与传统显微操作程序相反的方法，利用去除透明带的绵羊卵母细胞，先融合外来核，然后再去掉卵母细胞核，获得较好的结果，而且大大缩短了体外操作时间。

3 激活

目前主要有3种激活方案，即融合前激活、融合同时激活及融合后激活。激活后的卵母细胞，MPF活性降低，不会使移入其中的细胞发生PCC，阻止了G2期供体染色体的再复制现象，而Gl期和S期供体核仍可继续进行正常DNA复制，因而处于Gl、S和G2期的供核细胞仍继续原来的周期进程，保持正常核型。

4 细胞融合

电融合是通过在短时间强电场的作用下，使细胞的双层膜产生可逆性击穿，当这种击穿发生在相邻的细胞膜接触区域时，两侧的细胞膜瞬间接触并融合。由于该方法重复性好、细胞毒性小、融合效果好，后来逐渐被广大研究人员采纳。将电融合应用于胚胎细胞的融合，成为主要的融合方式。

5 胚胎培养和胚胎移植

克隆胚胎的移植方法和胚胎移植方法相同，关键是要保证移入胚胎的时期和受体母畜的生理周期一致，因为体外培养的核移植胚胎比体内发育的胚胎相对滞后，如果核移植胚胎在体外培养时间较长，对受体母畜进行同期发情处理的时间要相对晚些，这样才能够保证与核移植胚胎的时期同步化。