临床就诊犬布鲁氏菌病血清学调查

陈金娟 天津农学院动物科学系 300384

1 绪论

犬布鲁氏菌病是由布鲁氏菌侵入机体引起的传染变态反应性人畜共患传染病，国内外均有犬感染该病的报道。

犬布鲁氏菌病的检测主要采用国际标准中规定的虎红平板凝集试验 （RBPT）、试管凝集试验（SAT）和补体结合试验（CFT）[1]。这些方法具有敏感性高、特异性强的特点。但由于试管凝集试验和补体结合试验操作繁琐、费时，抗原、血清用量较大，试管、吸管反复刷洗，在标本量大的布鲁氏菌病监测中很不方便，微量凝集试验也在不断改革发展并日臻完善。微量凝集试验检测布鲁氏菌病抗体最早见于1988年的文献，方坚勇等用96孔V型血凝板、12号去针尖头接乳胶头为移液器，进行微量试管凝集试验，检测牛布鲁氏菌病抗体并进行卡方检验，得出微量法和试管法的检出率准确性一致的结论[2-3]。

1.1 布鲁氏菌

1.1.1 布鲁氏菌简介

布鲁氏菌又叫布氏杆菌，为革兰氏阴性短小杆菌，初次分离时多呈球状、球杆状和卵圆形。专性需氧，但许多菌株，尤其是在初代分离培养时尚需5%～10%的二氧化碳。最适生长温度为37℃，最适pH为6.6～7.4。该菌传代培养后渐呈短小杆状，菌体无鞭毛，不形成芽胞，毒力菌株可有菲薄的荚膜。1985年世界卫生组织(WHO)布鲁氏菌病专家委员会将布鲁氏菌属分为6个种19个生物型 [4]，即羊种（生物型 1～3），牛种（生物型 1～7.9），猪种（生物型1～5）及绵羊型副睾种，沙林鼠种，犬种（各1个生物型）。我国已分离到羊种、牛种、猪种、绵羊型副睾种和犬种各1个型。临床上以羊、牛、猪3种易感性最强，羊种致病力最强。

1.1.2 流行情况

布鲁氏菌可引致多种动物和人的布鲁氏菌病，细菌可经气溶胶传播，是潜在的生物武器。一年四季均可发病，流行区在发病高峰季节（春末夏初）可呈点状暴发。常呈地方性流行。病畜主要通过流产物、精液和乳汁排菌，污染环境。羊、牛、猪的易感性最强。母畜比公畜，成年畜比幼畜发病多。带菌动物尤其是病畜的流产胎儿、胎衣是主要传染源。以感染羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌最为严重。

本病流行于世界各地，我国多见于东北、西北等牧区。该病于20世纪50～60年代在中国有较严重流行，到20世纪90年代下降为0.01%。然而从1993年起布鲁氏菌病疫情出现了反弹，人间布鲁氏菌病疫情回升幅度较大，畜间布鲁氏菌病也呈上升情况。2003～2005年，农业部对12个省市部分奶牛场的4108份乳样进行布鲁氏菌病检测，从10个省检出203份阳性乳样，阳性率达4.94%。

1.1.3 布鲁氏菌病的防控

我国推广"检疫、免疫、捕杀病畜"的综合性防治措施，同时针对疾病流行的3个环节采取相应措施：非疫区以监测为主；稳定控制区以监测净化为主；控制区和疫区实行监测、扑杀和免疫相结合的方法。

免疫接种：疫情呈地方性流行的区域，应采取免疫接种的方法。免疫接种范围内的牛、羊、猪、鹿等易感动物。根据当地疫情，确定免疫对象。

检疫：异地调运的动物，必须来自于非疫区，应凭当地动物防疫监督机构出具的检疫合格证明调运。动物防疫监督机构要对调运的种用、乳用、役用动物进行实验室检测。检测合格后，方可出具检疫合格证明。调入后应隔离饲养30d，经当地动物防疫监督机构检疫合格后，方可解除隔离。

人员防护：饲养员每年要定期进行健康检查。发现患有布鲁氏菌病的应调离岗位，及时治疗。

防疫监督：布鲁氏菌病监测合格，应为奶牛场、种畜场发放《动物防疫合格证》或审验合格的证明。动物防疫监督机构要加强辖区内奶牛场、种畜场的检疫净化情况的监督检查。鲜奶收购点（站）必须凭奶牛健康证明收购鲜奶。

1.2 布鲁氏菌病的检测方法

布鲁氏菌病常表现为慢性或隐性感染，其诊断和检疫主要依靠血清学检查及变态反应。目前血清学检查是诊断布鲁氏菌病的常用方法[5-8]，主要有虎红平板凝集试验、试管凝集试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。

1.2.1 虎红平板凝集试验

此法简便，快速易行，比较敏感，适合于现场大批检疫时做筛选检查。但该法具有一定的假阳性，所以不宜做最后诊断。

1.2.2 试管凝集试验

试管凝集试验自Wright建立以来一直是各国诊断布鲁氏菌病的常规血清学诊断方法，在布鲁氏菌病的检测和控制规划中发挥了巨大的作用。试管凝集试验操作简便，判定容易，有广阔的应用前景，我国将其列为动物布鲁氏菌病诊断的国家标准。然而，《动物布鲁氏菌病诊断技术》(GB/T18646～2002)规定的方法是早些年根据当时的实验室仪器设备条件建立的，随着实验仪器设备的发展与更新，近年来认为试管凝集试验可以改进为微量法在96孔微量板上操作[9]，而且比传统的试管凝集试验具有许多优点。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)

用ELISA检测标本中的抗原或抗体是20世纪70年代初创立的一项技术，主要有间接ELISA试验和竞争ELISA试验。该技术具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高、测定成本低等优点，将酶联反应的高效性与免疫反应的特异性、高度专一性有机结合成为具有推广应用价值的技术[10]。Cav-leson等(1976)首次应用ELISA检测牛布鲁氏菌病抗体并发现其敏感性比试管凝集试验高10～100倍。谷登峰等(1989)建立了一种 Dot-ELISA和单克隆抗体相结合的检测方法，对10头健康牛和2个可疑奶牛场的15份奶牛血清进行快速诊断，结果在传统的试管凝集试验均为阴性的情况下，ELISA阳性率为14.78%。证明该方法具有特异、敏感、实用的优点。

1.3 实验研究的目的、方法及预期目标

布鲁氏菌病是我国乙类传染病。布鲁氏菌病主要侵害机体淋巴系统和生殖系统，家畜患病后可以发生胎膜发炎、不孕、不育、流产、睾丸炎、乳腺炎以及各种组织病变等。人感染后主要表现为波状热、多汗、关节痛、神经痛及肝、脾肿大、关节变形等，病程较长且易复发。该病广泛分布于世界各地尤其是畜牧业发达的国家和地区。据调查，全世界200多个国家和地区中已有170多个存在布鲁氏菌病疫情，每年造成的损失高达数百亿美元[11]。

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

收集100只前来天津农学院动物医院就诊的、需静脉采血检验的临床犬的血样。

2.1.1 主要仪器

移液器：北京雷勃尔离心机有限公司Y91921 20-200μl

北京雷勃尔离心机有限公司 Y74797 10-100μl

北京雷勃尔离心机有限公司 Y73441 100-1000μl

离心机：北京雷勃尔离心机有限公司 LZD 5-D

2.1.2 主要试剂

苯酚：天津市永大化学试剂有限公司 批号：Z0110418

氯化钠注射液（0.9%：吉林科伦康奈尔制药有限公司 批号：S070737HZ

犬布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原：中国兽医药品监察所 批号：201001

犬布鲁氏菌病高免血清：中国兽医药品监察所批号：2011-3

犬布鲁氏菌病阳性血清：中国兽医药品监察所批号：2009-1

2.1.3 其他器械用品

酒精棉球、无齿镊子、2ml注射器、橡胶管、一次性使用塑料试管滴管、移液器枪头、载玻片、牙签、恒温箱、显微镜。

2.2 试验方法

2.2.1 样品采取

对来天津农学院动物医院检验室抽血化验的临床就诊犬利用无菌操作采集静脉血 （2～2.5ml），询问畜主患病犬的主要症状、年龄、性别、品种、繁育史并对收集的血样进行编号，将数据记录于登记表。采集的血样立即用离心机（3600r/min 2～3min）离心，吸取上层血清，-20°C冷冻保存。

2.2.2 虎红平板凝集试验

待测血清预处理：将冷冻过的待测血清放入恒温箱内10min左右，使其解冻。

虎红平板凝集试验操作方法：用微量移液器分别取2滴犬布鲁氏菌病虎红平板凝集阳性抗原于载玻片上，再分别取犬布鲁氏菌病阳性血清、犬布鲁氏菌病阴性血清各1滴与上述抗原混合，并用牙签搅拌均匀（见图1）。于另一块载玻片上分别取3滴犬布鲁氏菌病虎红平板凝集阳性抗原，将编号为001、002、003的待测血清各1滴与上述抗原混合，用牙签搅拌均匀，3-5min内观察结果（见图2）。以此类推，继续进行编号004～100的待测血清的试验。

虎红平板凝集试验结果判定：在阳性血清与阳性抗原出现明显凝集颗粒，阴性血清与阳性抗原之间仍均匀浑浊的前提下，待测血清如与阳性抗原出现明显凝集颗粒，则判为阳性；如均匀浑浊，则判为阴性；介于二者之间则为可疑。

2.2.3 微量凝集试验

对虎红平板凝集试验呈阳性或可疑的血清抗体进行定量检测。

血清的稀释和加入抗原：准备好96孔板。第一孔加入115μl石炭酸生理盐水，第二孔不加，第三、四、五管各加入20μl，第六、七孔不加，第八孔加20μl。其中第六、七、八孔分别是阴性血清（Abˉ）、阳性血清（Ab＋）、抗原对照组。用移液器吸四孔中吸取20μl加入第五孔，第五孔混匀后弃去20μl。第六、七管分别加入20μl待测血清，第八孔不加。这样从第二孔到第五孔血清稀释度分别为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200。血清稀释后即可加入抗原。每孔加入20μl阳性抗原，震荡均匀。见表 1。

记录结果：将96孔板充分震荡后置于37°C～38°C恒温箱中恒温30min，观察并记录结果。

微量凝集试验结果判定：根据各孔中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。

3 实验结果

3.1 虎红平板凝集试验结果∶阳性血清0份（0/100）,可疑血清 5 份（5/100），阴性血清 95 份。

3.2 微量凝集试验结果∶阳性血清0份（0/100）,可疑血清0份（0/100），阴性血清100份。

表 2 虎红平板凝集和微量凝集试验结果

4 讨论

4.1 对虎红平板凝集试验和微量凝集试验结果的分析

在100份临床就诊犬血清中，应用虎红平板凝集试验测得可疑率为5%，而微量凝集试验则无可疑病例，由此可以从侧面反映出微量凝集试验与虎红平板凝集试验相比具有较好的敏感性和特异性。利用显微镜观察试验结果，就免去了人为主观因素的影响，对结果的判断更为准确和客观。

4.2 关于虎红平板凝集试验的准确性

布鲁氏菌诱导动物产生最多的抗体是IgG1，其次为IgM抗体，虎红平板凝集试验和微量凝集试验检测的主要是IgM抗体，容易受到动物体内其它IgM抗体的干扰。虎红平板凝集试验特异性不高，受试验温度、凝集时间相对较短和人为主观因素的影响，不易准确判定结果。

4.3 关于微量凝集试验的准确性

微量凝集试验是我国布鲁氏菌病的法定检测判定方法，但是该方法由于操作繁琐、费时，不适于在牛、羊饲养场现场采用。而本实验采用的微量凝集试验在等比例减少了试验中各试剂的量之后，可以在一定程度上缩短反应时间。

5 结论

100 只随机抽样临床就诊犬的犬种布鲁氏菌感染率为0；微量凝集试验借助显微镜来观察结果，可减小因肉眼观察带来的试验误差，提高试验结果的准确性。

［1］国家技术监督局，中华人民共和国卫生部.GB15988-1995布鲁氏菌病诊断标准及处理原则［S］.1995.

［2］卫生部政策法规司.WS269-2007.布鲁氏菌病诊断标准［S］.北京：人民卫生出版社，2007.

［3］方坚勇，刘胜红.用微量试管凝集试验检测布鲁氏菌病抗体的研究［J］畜牧兽医，1998，39（3）：131.

［4］吴清民.兽医传染病学[M].北京：中国农业大学出版社，2002：187～193.

［5］ Morgan WJB，MacKinnon DJ，Lawson JR，et al.The rose bengalplate agglutination test in the diagnosis of brucellosis［J］.VetRec，1969，85(23):636～641.

［6］ Nicoletti P.An evaluation of serologic tests used to diagnose.Brucellosis in buffaloes(Bubalus bubalis)［J］.Trop Anim Health Prod，1992，24(1):40～44.

［7］ Mateu deAntonio EM，Martín M，CasalJ.Comparison of serologictests used in canine brucellosis diagnosis［J］.J Vet DiagnInvest，1994，6(2):257～259.

［8］宋翠平，徐辉，王志亮，等.检测布鲁氏菌病的四种血清学方法比较及国际标准单位的应用［J］.中国动物检疫，2003，20（2）:25～27.

［9］世界动物卫生组织,陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)［M］.农业部兽医局/中国动物卫生与流行病学中心译.第五版.2007.

[10] Barbro S，Wilfried K，Uwe T.A simple touch-downpolymerasechain reaction for the detection of canineparvorvirus and Feline panleukopenia Virus in feces.[J].Journal of Virological Methods，1995，55:427-433.

［11］Gul ST，Khan A.Epidemiology and epizootology ofbrucellosis:a review ［J］.Palostam Vet.J.2007，27(3):145～151.