天然乳酸菌饲料添加剂的开发与应用

刘彩红 河北科技大学 050018

1 绪论

1.1 饲料添加剂的定义及应用

1.1.1 青贮饲料

青贮是保存饲料营养成分的基本方法，它可靠、经济、简便。

青贮的过程实际上是一个复杂的微生物消长演变的过程，主要是通过发酵达到延长保质期和防止营养成分流失的目的。青贮的发酵过程分为三个阶段，预备发酵期、酸化成熟期和完成保存期。青贮过程中，主要微生物有乳酸菌、梭状芽孢杆菌、腐败菌、醋酸菌、酵母菌以及霉菌等，其中起关键性作用的是乳酸菌。此过程中，青贮饲料营养价值也发生着微弱的变化，主要的变化是青贮原料上的乳酸菌数量并不高，而青贮后乳酸菌的数量迅猛增加；发酵后糖的剩余量很少，基本上是半纤维素酶解所释放的戊糖；含氮量会由于蛋白酶的作用而减少；等等。

青贮饲料中的乳酸菌。

乳酸菌只是一种习惯叫法，并不是微生物分类学上的名称，但乳酸菌的习惯叫法已被广大学者和民众接受。张刚等给乳酸菌的定义是：乳酸菌是一类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌。在自然界分布广泛，在土壤、植物根际，许多人类食品、动物饲料，还有河水中都有乳酸菌。大多数乳酸菌有益于人体和动植物，被称为“益生菌”。李平兰等指出，大多数乳酸菌能分泌酶类，形成生理性屏障，因此能间接地排斥、抑制有害菌的生长。不仅如此，杨良等指出乳酸菌还有调节胃肠机能功、免疫等功能。周勃则在《乳酸菌对肉鸡生长的影响》一文中指出，在肉鸡日食粮中合理加入乳酸菌，能降低病发率，降低料肉比，还能够使鸡羽毛光顺、紧贴体表、发育整齐。

自从巴斯德于1857年首次在研究乳酸发酵过程中发现乳酸菌后，乳酸菌就在人们的生产生活中发挥着重大的作用。而青贮饲料中乳酸菌的作用更是不容忽视。青贮饲料中的乳酸菌主要有乳球菌和乳杆菌等。青贮发酵过程中的条件控制就是创造乳酸菌最适生长的环境条件。一般是含水量在60%～70%，温度在40℃以下，其次对装填量也有要求，一般是每30cm左右踩实一次，尤其要注意边缘的踩实情况。

青贮过程是把青贮饲料贮存在缸、池、窖及塑料袋中，刚开始主要是一些好氧性细菌（腐败菌、霉菌、醋酸菌等）利用原料中残存的氧气进行呼吸作用，pH值下降缓慢，待氧气消耗尽，乳酸菌便成为优势菌群，开始大量繁殖产生乳酸使原料酸碱度迅速下降并维持在3.5～4.2之间。在此酸度下好氧性微生物的生命活动都处于抑制的稳定状态，蛋白酶的活性也受到了抑制。代素贞等指出，加入乳酸菌可使青贮中的游离氨基酸含量明显下降，这样便使青贮饲料的适口性增强，营养物质不易流失。

1.1.2 饲料添加剂

饲料添加剂是指在饲料加工、制作、使用过程中添加少量或微量物质。其目的在于完善饲料中营养物质的不足，改善饲料品质，提高饲料的利用率，抑制有害物质的产生，防止畜禽疾病，增进动物健康，从而大大提高动物生产能力，改进畜产品品质，节约饲料及增加经济效益。根据对青贮的使用目的和作用原理可将饲料添加剂分为微生物添加剂、营养添加剂、防腐添加剂、吸附剂和发酵抑制剂。

微生物添加剂。

微生物添加剂（SIB）也称青贮接种菌，是专门用于饲料的一类微生物添加剂。由一种或一种以上的乳酸菌、酶和一些活化剂组成。其目的是通过调节原料内的微生物区系来调节和控制青贮的发酵过程，为乳酸菌的大量繁殖，短时间内产生大量乳酸创造条件。从而增加青贮料中乳酸菌的数量，克服化学添加剂的不足和为调制优质青贮料提供保证。国外对微生物添加剂的研究较早，时建忠在《国外青贮接种菌研究进展》中详细阐述了国外接种菌的研究状况，他指出，美国所接种的乳酸菌活力旺盛，每克原料的乳酸菌达到105之高，而且并不是单一的菌系。在我国国标中规定的作为饲料添加剂的微生物有地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母及沼泽红假单胞菌。然而，我国现在市场上同类的产品依然较少，存在的缺点也很显著，主要是产品的菌种单一，不能将菌系联合应用，贮藏期短导致很难推广。

防腐添加剂。

防腐剂是指天然或合成的化学成分，用于加入到食品、药品、颜料、生物标本中，以延迟微生物生长或化学变化引起的腐败。其主要作用是抑制微生物的生长和繁殖，以延长物质保存时间，抑制物质腐败。常用的有亚硝酸盐、甲醛等。甲醛是研究较多的一类青贮饲料防腐添加剂，甲醛俗称福尔马林，商业用的是40%的甲醛水溶液。甲醛可以抑制各种微生物的活动，不仅具有良好的防腐作用，而且可以防止饲料蛋白质在反刍动物瘤胃内被降解。但有研究表明，甲醛具有潜在的致癌危险，用时应当谨慎。

1.1.3 乳酸菌饲料添加剂

乳酸菌是青贮饲料微生物添加剂中最重要的一种，也是应用最早的一种。依照乳酸菌产酸的能力可以分为两类：同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌，而青贮过程中起关键性作用的是同型发酵乳酸菌。筛选并培养最适合的发酵青贮用乳酸菌成为近30年青贮研究的热点。目前使用的菌种有Lactobacillus plantarum，Enterococcus faecium 和Pediococcus pentosaceus等。乳酸菌的益生作用受到了人们的广泛关注，它们的生物学功能更是不可忽视，尤其是其维持微生态平衡和肠道机能的作用、抗菌作用、降低血清胆固醇水平的作用和增强免疫功能和预防肿瘤的作用。把乳酸菌作为青贮饲料添加剂主要是利用了乳酸菌的抑菌作用。饲料接种乳酸菌后pH值会快速下降，其他腐败菌因不能在较低pH值下生存而死亡，最终的pH值也会达到很低的水平，有助于降低那些产生高水平乙酸、丁酸的有害微生物的数量，而且能提高干物质的回收率，从而最终提高青贮饲料的利用率。

1.2 细菌素

1.2.1 细菌素的定义

细菌素是一种多肽或多肽与糖和脂的复合物，是许多细菌产生的抗细菌肽或蛋白。细菌素既可自发产生也可诱导产生。细菌素不同于抗生素，细菌素由质粒控制，对同种近缘菌株呈现狭窄的活性抑菌谱，附着在敏感细胞特异性受点上，虽然细菌素的抗菌谱很窄，只能作用于特定的有害菌，但若能选择适合的细菌素，就能保证在抑制有害菌种的同时不会影响其他有益菌种的存活。细菌素本质上是蛋白质类，可以被消化道中的特定蛋白酶降解，在肠道中不会有残留，而抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，是能干扰其它活细胞发育功能的化学物质。重复使用抗生素可能会使致病菌产生抗药性。与抗生素相比较，生产细菌素的细胞对其产生的细菌素具有免疫功能，这也是细菌素与抗生素的主要区别。

1.2.2 细菌素的应用及展望

细菌素无毒、无残留、无抗药性、无副作用，不仅具有防腐的作用，而且不会在体内积蓄引起不良反应，在体内易被消化道中的部份蛋白酶降解。甘晓玲指出，细菌素用于奶制品可以抗Clostridial和Listeria。奶制品中，Nisin的使用最为广泛也最为成熟，已成功地应用于乳制品如硬制干酪、巴氏杆菌干酪、巴氏灭菌奶、罐藏浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶和酸奶等。

目前国际上通常采用物理和化学两种方法对食品进行防腐保鲜。与工业用防腐剂不同，食品防腐剂的安全卫生问题日益受到人们关注，消费者对添加化学防腐剂的食品心存顾忌。化学防腐剂的安全隐患不容忽视，寻找一种新的代用品以减少化学防腐剂所造成的潜在危害已为各国科研工作者所关注。然而随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食品安全性的要求越来越高。因此，选择安全有效的防腐剂成为食品防腐保鲜的一项重要工作。人们把研究重点放在生物防腐剂的研究中并取得了很好的效果。生物防腐剂是通过生化反应来达到防腐的效果。细菌素作为生物防腐剂的一种，具有其他非微生物防腐剂所不能比拟的优点，因此应用前景广泛。目前，新型细菌素的研究手段层出不穷，包括人工合成、克隆技术、基因组序列等。我们有理由相信在不久的将来一定会更加详尽地揭示出细菌素的功能、抑菌原理、基因结构甚至是遗传位点。

1.3 乳酸菌细菌素

1925 年，Gratia发现了大肠杆菌产生的Co1icine。以后几十年国外学者开始了乳酸菌细菌素的研究，研究方向主要集中在对Nisin的研究。近几年国外学者对乳酸菌细菌素的研究主要集中在提取新的乳酸菌细菌素、细菌素检测方法、细菌素的纯化方法、细菌素蛋白质结构和编码基因等方面。乳酸菌细菌素蛋白质结构上不同部位有不同的电价，可造成指示菌细胞膜结构的部分改变，其主要杀菌机制是先吸附在目标菌的细胞膜上，再侵入膜内形成通透孔道，以引起细胞内物质如ATP、K+等的流失或细胞生化反应障碍，而导致目标菌的死亡。

目前，乳酸菌是世界上公认的食品级微生物，当然其产生的乳酸菌细菌素也是安全的。乳酸菌细菌素对病原菌和食品腐败菌均有抑制能力，可以把乳酸菌细菌素作为天然防腐剂应用于食品工业。根据生物多样性和进化论观点，每种乳酸菌所产生的细菌素至少有一种，并且具有相对固定的抗菌谱。研究表明，温度和酸碱度都能影响乳酸菌细菌素的活力。如单春乔等以大肠埃希菌为指示菌作嗜热乳杆菌的抑菌试验,发现随温度的升高，抑菌活性变化不大，活性均能达到80%以上。陈静等指出，嗜酸乳杆菌细菌素的抑菌活性只有在酸性条件下才能表现出来，并随酸度的升高抑菌活性也随之升高。目前，乳酸菌细菌素已成功地应用于乳制品如硬制干酪、巴氏杆菌干酪、巴氏灭菌奶、罐藏浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶等；肉制品如熏猪肉、咸猪肉、香肠、火腿、真空包装新鲜牛肉等；罐装蔬菜如番茄、马铃薯、蘑菇、龙须菜等。

1.4 本课题研究的目的与意义

近30年来，国内外青贮技术研究的热点主要集中在生物青贮剂的研究方面。生物青贮剂通过调节控制青贮发酵过程，促进乳酸菌大量繁殖更快地产生乳酸，促进营养物质的吸收，从而有效地提高青贮饲料的质量。国外众多的科技人员对此做了大量的科研工作，如Giorgio Giraffa指出，乳酸菌是广泛用于青贮饲料的添加菌株，其主要代谢产物乳酸可以迅速降低原料的pH值，可以提高饲料的适口性，而且所产生的细菌素影响着最终产品的品质和营养。我国在该领域的研究还刚刚起步，饲料添加剂的应用研究需要给予高度重视。

本课题随机抽取了河北省五个市县的青贮饲料，从青贮饲料中分离筛选一株或几株性质优良的乳酸菌，并用筛选得到的乳酸菌发酵棉粕。主要针对乳酸菌发酵过程中的代谢物在抑菌方面和营养细化方面加以研究，同时以测定棉粕中棉酚和蛋白质含量的变化作为青贮饲料营养提高的一个观测点，为开发益生菌制品、生物防腐剂提供基础性材料和理论依据。随着对绿色、环保、无公害畜产品的需求增加，能代替抗生素的抗菌剂成为人们寻找的目标，细菌素便成为了近年来研究的热点。

1.5 试验路线

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 青贮饲料

所用青贮饲料来自河北省五个市县。见表1。

表 1 青贮饲料来源

2.1.2 实验菌株

以河北科技大学微生物实验室保藏的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌作为指示菌。

2.1.3 棉粕

棉粕：四级品。

2.1.4 药品试剂

蛋白胨（北京奥博星），酵母膏（北京奥博星），牛肉膏（北京奥博星），葡萄糖（天津百世），吐温80（天津红岩），硫酸镁（天津永大），硫酸锰（天津培欢），氢氧化钠（天津大陆），氯化钠（天津富禄），琼脂（北京奥博星），丙三醇（天津永大），乙酸铅（天津化学试剂三厂），30%过氧化氢（石家庄市卫民消毒制品），氢氧化钾（天津百世），明胶（天津博迪）。以上试剂均为化学纯。

2.1.5 培养基

TGE肉汤培养基的配制：蒸馏水1000mL、蛋白胨10.00g、酵母浸提物4.00g、牛肉膏6.00g、葡萄糖 10.00g、硫酸锰 0.05g、硫酸镁 0.10g、吐温 80为0.2%，pH 为 6.5，0.08Mpa灭菌 30min。

MRS液体培养基的配制：蒸馏水1000mL、蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、酵母提取物 5.0g、K2HPO4 2.0g、柠檬酸三铵 2.0g、乙酸钠 5.0g、葡萄糖 20.0g、 吐 温 80 1.0mL、MgSO4·7H2O 0.5g、MnSO4 ·4H2O 0.25g，pH6.2 ～6.4，115℃ 灭 菌25min。

硫化氢培养基的配制：蒸馏水1000mL、蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、酵母提取物 5g、NaCl 5g、半胱氨酸 0.4g、葡萄糖 2g，pH7.2～7.4，113℃摄氏度灭菌20min。明胶液化培养基的配制：明胶12g、蛋白1g、酵母提取1g、葡萄糖0.1g、盐溶液4.0mL、蒸馏水 100mL，pH7.0，113℃～115℃高压蒸汽灭菌 15～20min。

乙酰甲基甲醇（PY）培养基的配制（VP试验）：蛋白胨0.5g、胰酶解酪朊0.5g、酵母提取物1.0g、盐溶液4.0mL、蒸馏水100mL。

盐溶液成分：蒸馏1000mL、无水CaCl2 0.2g、MgSO4 ·7H2O 0.48g、K2HPO4 1.0g、KH2PO4 1.0g、NaHCO3 10.0g、NaCl 2.0g。

LB液体培养基的配制：蒸馏水 1000mL、NaCl 10.00g、蛋白胨 10.00g、酵母浸提物 0.50g、用 5mL NaOH调节pH为7.0～7.2，0.15Mpa灭菌 20min。

牛肉膏蛋白胨（肉汤）培养基的配制：蒸馏水1000mL、牛肉膏 3.00g、NaCl 5.00g、蛋白胨 8.00g、用5M NaOH调节pH为7.4～7.6，0.15Mpa灭菌20 min。

固体、半固体培养基的配制：在上述液体培养基中加入1.5%琼脂粉制备固体培养基，加入0.8%琼脂粉制备半固体琼脂培养基。

2.1.6 仪器

HYG-XX自动摇床 （上海欣蕊自动化设备有限公司）

HHB11-600电热恒温培养箱 （天津市华北实验器材有限公司）

SW-CY-2FD洁净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）

YXQG02电热手提式蒸汽压力灭菌锅（山东新华医疗器械股份有限公司）

BC|BD-24|GSA 2G海尔电冰柜 （山东青岛海尔有限公司）

J200G＆G高精度电子秤 （上海丽度电子科技发展有限公司）

IH-G20富士宝电磁炉 （富士宝电器科技有限公司）

B1 Series Motic显微镜 （麦克奥迪实业集团有限公司）

CSIOI3电热鼓风干燥箱（重庆仪器）

DL-1510低温冷却液循环机（宁波新芝生物科技股份有限公司）

LABOROTA 4000 EFFICIENT旋转蒸发仪（德国Heidolph集团）

BAKER SPE-24固相萃取仪（美国JT Baker）

GP/5-2SV1-S1FR空气压缩机 （日本岛津公司）

81-2 恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）

AA-6100原子吸收分光光度计 （日本岛津公司）

infraxact/近红外分析仪（丹麦福斯集团公司）

SOXTEC-2043索氏脂肪提取仪（丹麦福斯集团公司）

ANKOM-220粗纤维测定仪 （美国ANKOM公司）

PHOENIX微波马弗炉（美国CEM公司）

ETHOSE微波消解炉（意大利麦尔斯通公司）

KJELTEC-2300蛋白消化炉（丹麦福斯集团公司）

KJELTEC-2300全自动定氮仪（丹麦福斯集团公司）

2.2 方法

2.2.1 样品的制备

在青1、青 2、青 3、青 4、青 5中分别取少量青贮饲料于生理盐水中，震荡均匀后，滤去青贮饲料残留物，将所得液体进行涂布培养。

2.2.2 乳酸菌的分离培养

涂布培养：用移液枪将震荡后的液体接种于已灭菌的MRS固体培养基上，用"L"形玻璃棒反复涂布几次，直到使菌液均匀分散在固体培养基表面。于37℃培养箱中倒置培养48h。

制备乳酸菌悬液：用接种环挑取有典型特征的菌落置于装有已灭菌的MRS液体培养基的试管内，于自动摇床内培养24h。

斜面接种法：用接种环蘸取菌液从已灭菌的MRS培养基的固体斜面的底部向上蜿蜒涂布，37℃培养箱中静置培养48h。

倾注平板法：将菌液和培养基在适宜的温度混合均匀后，倾入已灭菌的平皿内，待凝固后在37℃培养箱中倒置培养。

穿刺接种法：从试管中用灭菌的接种针蘸取适量菌液垂直刺入已灭菌的培养基的中心直达试管底部，但不完全刺到管底，在适宜温度下培养。

2.2.3 菌种保藏

将灭菌后的甘油和菌液以1∶1(500μL)的比例混合移入1.5mL离心管中，于-18℃的冰箱内保藏，备用。

2.2.4 乳酸菌的鉴定

革兰氏染色观察：用灭菌的接种环蘸取菌液置于干净的载玻片上，经过制片后经初染、媒染、脱色、复染后观察菌株的颜色、大小，并记录形状。

乙酰甲基甲醇（VP实验）：

甲液：6%α-萘酚-乙醇溶液；乙液：40%氢氧化钾溶液。

取适量菌液置于试管内，加入6%α-萘酚-乙醇溶液1mL，然后加入40%氢氧化钾溶液0.4mL，充分震荡后37℃培养箱中静置培养15～20min后观察，若溶液出现红色则为VP实验阳性，否则为阴性。

KOH实验：用灭菌的玻璃棒蘸取5%的KOH溶液置于干净的载玻片上，用灭菌的接种环蘸取菌液置于KOH溶液中，并用接种环迅速搅拌，若短时间内越搅越稠，且挑起会有拉丝的现象，则此为KOH实验阳性，否则为阴性。

过氧化氢酶实验：用灭菌的接种环蘸取菌液涂于干净的载玻片上，滴加30%过氧化氢，若有气泡产生则为过氧化氢酶实验阳性，否则为阴性。

硫化氢实验：

乙酸铅试纸条的制备：将普通滤纸剪成约0.5～0.6cm宽的纸条，长度根据试管和培养基高度而定。用50～100g/L的乙酸铅将纸条浸透，置于烘箱内烘干，然后放入培养皿或试管内，灭菌后备用。

观察现象，若纸条变黑为过氧化氢酶实验阳性，否则为阴性。

葡萄糖产酸产气实验：

培养基（1000mL）：在PY基础培养基中加入30g葡萄糖、0.5mL吐温80和6g琼脂，再加入浓度为1.6g/100mL的溴甲酚紫1.4mL作指示剂，分装试管，湿热灭菌（121℃，0.1MPa，20min），竖立静置，自然降温凝固，备用。

接种培养及观察：用较大量的新鲜活力强的待测菌液进行穿刺接种，竖直放在试管架上于恒温培养箱中培养（37℃，24～48h）。观察并记录实验现象，培养基中指示剂变黄表示产酸；软琼脂柱内产生气泡表示产气。

明胶液化实验：将菌液接种于明胶液化培养基上，37℃培养箱中培养一段时间后置于冰箱中，待试管凝固。如对照管凝固时，接种管液化为明胶液化实验阳性，同时凝固为阴性。

吲哚实验：吲哚试剂的配制：将1g对二甲氨基甲醛溶液溶解于95mL的95%乙醇中，然后缓慢加入浓盐酸20mL。于试管中加入5mL灭菌的蛋白胨水培养基，用移液枪移入100μL，于37℃培养箱中培养24h后观察，并作空白对照。首先加入乙醚2mL，充分震荡后静置几分钟，再沿试管壁加入5～10滴吲哚试剂。若乙醚层出现玫瑰红色则为吲哚实验阳性反应，否则为阴性反应。

2.2.5 产细菌素乳酸菌的筛选（琼脂扩散法）

培养指示菌：

选取大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两株菌种作为指示菌。用接种环挑取活化的大肠杆菌接种于5mL的LB培养基37℃自动摇床培养24h。用接种环挑取活化的枯草芽孢杆菌接种于5mL的肉汤培养基37℃自动摇床培养24h，4℃冰箱保存待用。

制备滤纸片。

将适量滤纸用打孔机打成6mm的圆形滤纸片，115℃灭菌20min后备用。

筛选：

将200μL菌液放在离心管中，于-18℃下反复冻融5次，备用。

将100μL指示菌与对应的200mL培养基混合均匀后倒入平板内，用镊子夹起滤纸片在离心管内浸湿，将浸满菌液的滤纸片放在固体培养基的适当位置。同时，用氢氧化钠中和菌液，把菌液调至中性后，将100μL指示菌与对应的200mL培养基混合均匀后倒入平板内，用镊子夹起滤纸片在离心管内浸湿，将浸满菌液的滤纸片放在固体培养基的适当位置。将两种平皿同时置于37℃下静置培养16h后观察结果，并用游标卡尺测定抑菌圈大小，测定3次，取平均值。

2.2.6 生长曲线测定

将抑菌效果好的菌株接种于装有灭菌的TGE液体培养基的试管中，在37℃下自动摇床培养。从第4个小时起，每隔两小时取出一支并立即在600nm下测定光密度值，同时采用平板菌落计数法测定相应菌株的菌落总数。

测菌落总数时采用的稀释方法为梯度稀释法，即在第一个试管中放9mL培养基，用移液枪移入1mL菌液，混合均匀后，从第一个试管中用移液枪取出1mL菌液放入第二个装有9mL培养基的试管中，稀释到一定倍数后取200μL菌液于固体培养基上涂布均匀后培养，直到数出的菌落数在30～300之间，停止稀释。

2.2.7 发酵指标的测定

发酵时菌液接种量：

为保证发酵后所测指标的可比性，要使接种量至少达到105CFU/g。若菌落数较小则通过离心的方法获取沉淀物，若菌落数较大则加培养基，如此循环，直到总量一致为止。

本课题选取了菌落总数为2×1010CFU的菌液，将菌液与200mL无菌水和灭菌后的200g棉粕混合均匀后，在37℃条件下发酵4天，测定pH并进行晾晒，晾干后测定相关指标。

游离棉酚测定：

将棉粕样品用机械磨粉碎，使其全部能够通过2.8mm孔筛，混匀后装入密闭容器中，保存备用。

称取2.000g样品，置于250mL带塞的三角锥形瓶中，加入20粒玻璃珠，用移液管吸取50mL溶剂A（量取约2mL3-氨基-1-丙醇，500mL异丙醇、正己烷混合溶剂，50mL水、8mL冰乙酸于1000mL的容量瓶中，再用异丙醇-正己烷混合溶剂定容至刻度），塞紧瓶塞后将其放入振荡器内振荡1h（每分钟120次左右）。随后用干燥的定墩滤纸过滤，过滤的时候要在漏斗上加盖玻璃片，这样做的目的是减少溶剂挥发。将最初得到的几滴滤液弃去不用，将滤液收集在100mL带塞三角锥形瓶中。

用吸量管吸取两份等量的滤液10mL，分别装入两个25mL棕色容量瓶a和b中。

用异丙醇-正己烷混合溶剂稀释瓶a至刻度，摇匀后，作为样品的对照组。

用移液管吸取2份10mL的溶剂A分别至两个25mL棕色容量瓶a0和b0中。

用异丙醇-正己烷混合溶剂将容量瓶a0稀释至刻度，摇匀后，将该溶液作为空白的对照组。

在容量瓶b和b0中加人2.0mL苯胺，在沸水浴上加热30min，使其显色。

将其冷却至室温后，用异丙醇-正己烷混合溶剂定容，摇匀后，静置1h。

用10mm比色皿，采用分光光度计以a0为参比溶液测定空白测定液b0的吸光度，在波长440nm处，以a为参比溶液测定试样测定液b的吸光度，从样品测定液的吸光度值中减去空白测定液的吸光度值，就可以得到校正吸光度A。

计算公式为：

式中：X-游离棉酚含量，mg/Kg

A-校正吸光度

m-试样质量，g

V-测定用滤液的体积，mL

a-质量吸收系数，游离棉酚为62.5cm-1·g-1·L

粗蛋白测定：

参照GB/T6432-94进行粗蛋白测定。

方法：将样品进行粉碎，使其能全部通过40目筛。

称取0.5000g样品，放入消化管中，再加入两片消化片，在420℃下于消煮炉上消化1h，然后取出，待放凉后加入30mL的蒸馏水。

用全自动定氮仪按仪器本身常量程序进行测定。

再用0.1mol/L的标准盐酸溶液对吸收液进行滴定，当溶液的颜色有蓝绿色变为灰红色即为滴定终点。

同时做空白对照，称取0.5g的蔗糖，用来代替试样，按以上操作进行空白测定，要求消耗0.1mol/L的标准盐酸溶液的体积小于或等于0.2mL。然后根据下面的计算公式，得出蛋白质的含量：

式中：V2-滴定样品时标准盐酸溶液体积

V1-滴定空白时标准盐酸溶液体积

C-盐酸标准溶液浓度，mol/L

m-试样的质量，g

V′-试样分解液蒸馏用体积，mL

V-试样分解液总体积，mL

0.0140 -每毫克当量氮的克数

6.25 -氮换算成蛋白质的平均系数

脂肪测定：

参照GB2433-2006进行脂肪测定。

称取 5g（m1）式样，准确称量至 1mg。

将试料转移至一个400mL烧杯或一个300mL锥形瓶中，加100mL盐酸和金刚砂，用表面皿覆盖，或将锥形瓶与回流冷凝器连接，在火焰上加热混合物至微沸，保持1h，每10min旋转摇动1次，防止产物粘附于容器壁上。在环境温度下冷却，加一定量的滤器辅料，防止过滤时脂肪丢失，在布氏漏斗中通过湿润的无脂的双层滤纸抽吸过滤，残渣用冷水洗涤至中性。小心取出滤器并将含有残渣的双层滤纸放入一个提取套管中，在80℃电热真空箱中于真空条件下干燥60min，从电热真空箱中取出套管并用以小块脱脂棉覆盖。

将一些金刚砂转移至干燥烧瓶，称量（m2）准确至1mg。将套管置于提取器中，用石油醚提取6h。蒸馏出去溶剂，直至烧瓶中几乎无溶剂，加2mL丙酮至烧瓶中，转动烧瓶并在加热装置上缓慢加温以除去丙酮，吹去痕量丙酮。残渣在103℃干燥箱内干燥（10±0.1）min，在干燥器中冷却，称量（m3），准确至 0.1mg。

式中：

m1-试料的质量，单位为g

m2-带有金刚砂的烧瓶的质量，单位为g

m3-盛有金刚砂的烧瓶和获得的石油醚提取干燥残渣的质量，单位为g

f-校正因子单位，单位为g/Kg(f=1000g/Kg)

结果表示准确至1g/Kg

粗纤维测定：

参照GB2434-2006进行粗纤维测定。

称取约1g制备好的试样准确至0.1mg，转移至一带有约2g滤器辅料的滤锅中。

将消煮圆筒与滤锅连接，将150mL沸硫酸转移至带有滤锅的圆筒中，如果出现泡沫，则加数滴发泡剂，使硫酸尽快沸腾，并保持剧烈沸腾30min±1min。

停止加热，打开排放管旋塞，在真空条件下通过滤锅将硫酸滤出，残渣用热水至少洗涤3次，每次用水30mL，洗涤至中性，每次洗涤后抽吸干燥残渣。

将干过与冷提取装置连接，残渣在真空条件下用丙酮洗涤3次，每次用丙酮30mL。然后，残渣在真空条件下用石油醚洗涤3次，每次用石油醚30mL。每次洗涤后抽吸干燥残渣。

关闭排出孔旋塞，将150mL沸腾的氢氧化钾溶液转移至带有滤锅的圆筒中，加数滴防泡剂使溶液尽快沸腾，并保持剧烈沸腾30min±1min。

停止加热，打开排放管旋塞，在真空条件下通过滤锅将硫酸滤出，残渣用热水至少洗涤3次，每次用水30mL，洗涤至中性，每次洗涤后抽吸干燥残渣。

将滤锅置于灰化皿中，灰化皿及其内容物在130℃干燥箱中至少干燥2h。滤锅和灰化皿在干燥器中冷却，从干燥器中取出后，立即对滤锅和灰化皿进行称量（m2），准确至 0.1mg。

将滤锅和灰化盘置于马福炉中，其内容物在525℃下灰化，直至冷却后连续两次称量的差值不超过2mg。每次灰化后，让滤锅和灰化皿初步冷却，在尚温热时置于干燥箱中，使其完全冷却，然后称量（m3），准确至 0.1mg。

用大约相同数量的滤器辅料，按以上步骤进行空白测定，不加试样。灰化引起的质量损失不应超过2mg。

试样中粗纤维的含量按下式计算：

结果精确至1g/Kg。

水分含量测定：

根据GB/T10360的要求制备试样。用清理好的机械磨粉碎样品，机械磨需要用约5%的试样清洗，然后将粉碎物弃去不用。将其余的试样粉碎，使其能全部通过孔径为1mm的筛子，然后收集粉碎物，混匀后尽快用于测试。

其测定方法为：将平皿开盖放置于烘箱中，温度为40℃，放置0.5h。然后盖上盖，称量其重量。

称5g样品，均匀铺在平皿底上，然后盖上盖子称量。此操作应尽快完成，防止样品中的水分发生变化。

将此装有样品的平皿放置于电热烘箱中，温度调节为103℃，然后打开盖子，关上烘箱门。从温度到达103℃时开始计时，2h后打开烘箱门，盖上盖子，切断电源，关闭烘箱门，自然冷却。待冷却至室温后，迅速称重。

称重完毕，将平皿再次放入电烘箱，开盖，关上烘箱门，从温度到达103℃时开始计时，1h后盖上盖，重复上述操作，冷却后称重，直到两次连续称量之差等于或小于0.005g为止。

晾干前后pH测定：

用缓冲液以蒸馏水为标准调整pH，将pH计调"0"。

称取棉粕5.0g放入75mL的蒸馏水中混合均匀，将pH计放入溶液，待pH计读数稳定后开始计数，拿出后用蒸馏水清洗电极，测定下一样品。

3 结果与讨论

3.1 乳酸菌的分离与鉴定

经革兰氏染色观察和生理生化实验鉴定，共分离出51株乳酸菌，乳酸菌基本为杆状和球状。从革兰氏染色结果和生理生化实验结果（见表2）综合观察，查阅伯杰氏系统细菌学手册，得知所分离的菌属多为乳杆菌属和链球菌属。

从青1分离出了11株乳酸菌，记为XL1，XL1-1，XL11，XL15，XL12，XL13，XL14，XL1-1，XL1-2，XL11-1，XL11-2。

从青2中分离出了11株乳酸菌，记为XL2，XL2-3，XL22，XL22-1，XL21，XL22，XL23，XL24，XL2-1，XL22-1，XL22-2。

从青3中分离出了16株乳酸菌，记为XL3，XL3-1，XL33，XL33-1，XL33-2，XL331-1，XL331-2，XL332-1，XL332-2，XL31，XL32，XL3-2，XL34，X331-3，XL35，XL334-1。

从青4中分离出了6株乳酸菌，记为XL4，XL4-1，XL44，XL44-1，XL4-3，XL4-5。

从青5中分离出了7株乳酸菌，记为XL5，XL5-1，XL5-2，XL5-3，XL55，XL55-1，XL5-5

表 2 乳酸菌鉴别生理生化实验

注：“+”表阳性，“-”表阴性

3.2 产细菌素乳酸菌的筛选

发酵液抑菌效果见表3。

表 3 发酵液抑菌效果

XL33-2 XL331-1 XL331-2 XL332-1 XL332-2 XL44 XL44-1 XL55 XL55-1 XL15 XL12 XL13 XL14 XL21 XL22 XL23 XL24 XL31 XL32 XL1-1 XL1-2 XL11-1 XL11-2 XL2-1 XL22-1 XL22-2 XL2-3 XL34 XL331-3 XL35 XL334-1 XL4-3 XL4-5 XL5-5 6.56 6.44 6.26 6.28 9.02 7.12 7.58 6.62 6.46 6.56 6.52 6.08 6.50 6.36 6.40 6.24 6.22 6.48 6.62 7.02 6.34 6.68 6.60 6.24 6.42 6.58 6.86 6.56 6.78 6.36 6.20 7.00 6.24 7.32 7.06 6.88 7.04 6.48 9.02 8.66 8.98 6.78 7.08 6.72 7.42 6.88 6.78 6.64 6.90 6.90 6.92 6.60 6.78 6.98 6.28 7.42 6.52 8.00 7.08 6.56 7.82 6.26 6.78 6.62 6.34 7.24 6.80 7.22

从表3中可以看出，发酵液同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的乳酸菌菌株较少，而抑菌圈显著较大的仅为14株，分别为XL44，XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL1-1，XL2-1，XL11，XL4-3，XL3-1 和 XL1。

大多数菌株只能抑制革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。如XL24抑制革兰氏阴性菌的抑菌圈达到了6.92而抑制革兰氏阴性菌的抑菌圈大小仅为6.22。

只有极少数乳酸菌菌株对革兰氏阳性菌和阴性菌几乎没有效果，一共2株，分别为XL4和XL11-2。

排除酸影响后的效果见表 4。

表 4 排除酸抑菌效果

XL15 XL12 XL13 XL14 XL21 XL22 XL23 XL24 XL31 XL32 XL1-1 XL1-2 XL11-1 XL11-2 XL2-1 XL22-1 XL22-2 XL2-3 XL34 XL331-3 XL35 XL334-1 XL4-3 XL4-5 XL5-5 6.38 6.04 6.00 6.36 6.04 6.34 6.08 6.00 6.24 6.08 6.46 6.26 6.02 6.48 7.08 6.00 6.38 6.46 6.00 6.44 6.28 6.06 8.00 6.06 6.96 6.06 6.44 6.24 6.48 6.52 6.00 6.62 6.66 6.42 6.12 6.00 6.08 6.94 6.34 6.06 7.06 6.38 7.58 6.22 6.00 6.58 6.20 6.96 6.44 7.00

从表4中可以看出，发酵液同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的乳酸菌菌株较少，而抑菌圈显著较大的仅为9株，分别为XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL2-1 和XL4-3。

只有极少数的3株乳酸菌菌株对革兰氏阳性菌和阴性菌几乎没有效果，分别为 XL3，XL5，XL11。

大多数菌株只能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌其中的一种。如XL22-1抑制革兰氏阴性菌的抑菌圈达到了7.06，而抑制革兰氏阳性菌的抑菌圈大小仅为6.00。

综合以上考虑选取了不仅发酵液抑菌效果好而且排除酸影响后抑菌效果好的菌株，且对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑菌效果的XL44，XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL2-1和XL4-3这9株菌做发酵实验。

从这9株菌株中做抑菌圈大小的比较，可以看出XL332-2和XL44-1在排除酸影响后对革兰氏阳性菌和阴性菌的抑菌圈大小均比其他菌株要大且达到6.8以上。在排除酸影响后抑菌效果仍然如此之强，推测可能是细菌素的作用，也就是我们要找的目标菌株。这两株菌株对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑菌作用，其抑菌谱很广。

自发酵晾干成成品后至今，各个发酵棉粕的样品在常温下保存均未有腐败现象发生。

3.3 发酵结果与分析

XL2-1的潜伏期较短，对数期增长快，且OD值是这几株菌株中最大的。而XL5-5潜伏期长，达到对数期所用的时间长，最终的OD值最小。而筛选出的产细菌素较好的XL332-2和XL44-1两株菌株的生长曲线与 XL44，XL4-1，XL2-3，XL5-3，XL4-3这5株菌株没有显著区别。

综合以上实验结果可以看出，各个菌株均在16h左右达到0D值的最大值，也就说明了这9株产细菌素乳酸菌的最佳接种期为16h。其具体菌落数的结果如表5所示。

表 5 对数期菌落数的测定

发酵结束后棉粕的各项具体指标见表6。

表 6 发酵后各项指标

发酵后指标分析：

从粗纤维组来看，XL5-5对减少粗纤维含量效果较好，较空白组减少了14.43%。晾干前XL2-1的酸碱度最低，晾干后为6.23，酸碱度居中。从含水量来看，XL332-2总体来说含水量较大。

从蛋白质组来看，XL4-3对提高蛋白质含量高于其他菌株，较空白组提高了4.68%,而较成品棉粕提高了0.9%。这说明乳酸菌不仅能起到抑菌作用，对于提高饲料的蛋白质含量也有一定的作用。

从脱酚率来看，XL5-5的效果最好，高达20.15%。

4 结论

经过涂布培养、划线培养，确定从河北五个市县的青贮饲料中得到51株菌种，经菌落及个体形态观察、革兰氏染色、及生理生化实验确定为乳酸菌。其中有 8株乳球菌，分别为 XL12，XL13，XL22，XL31，XL11-1，XL24，XL1-2，XL11-2，43株乳杆菌分别为 XL1，XL1-1，XL2，XL2-1，XL3，XL3-1，XL4，XL4-1，XL5，XL5-1，XL5-2，XL5-3，XL11，XL22-1，XL33，XL33-1，XL33-2，XL331-1，XL331-2，XL332-1，XL332-2，XL44，XL44-1，XL55，XL55-1，XL15，XL14，XL22，XL23，XL32，XL1-1，XL2-1，XL21，XL44，XL22-1，XL22-2，XL3-2，XL331-3，XL35，XL334-1，XL4-3，XL4-5，XL5-5。

通过对发酵液抑菌效果和排出酸影响后抑菌效果的分析，从分离出的51株乳酸菌中筛出9株抑菌性质优良的乳酸菌，分别是XL44，XL332-2，XL5-5，XL44，XL4-1，XL44-1，XL2-3，XL5-3，XL2-1和XL4-3，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌作用，其中XL332-2和XL44-1这两株菌株的抑菌圈大小无论是在发酵液抑菌时的抑菌圈还是排出酸影响后的抑菌圈均比另外7株菌株的抑菌圈大。

综上所述，XL332-2和XL44-1为我们所找的目标菌，即产细菌素好的菌株。XL4-3提高蛋白质的含量能高于发酵成品，说明乳酸菌不仅抑菌能力强，而且能提高饲料中的蛋白质含量，这也是本实验的新发现。