脑膜癌病小鼠模型实验方法的改进

李媛媛 刘亚坤 李忠尧 韩玮欣 何俊瑛 卜晖

脑膜癌病 （leptomeningeal carcinomatosis,LC）是原发肿瘤细胞转移，局灶或弥漫浸润软脑膜及蛛网膜下腔，并播散至脑脊液[1-2]，是恶性肿瘤中枢神经系统转移的一种较少见类型，原发肿瘤常为肺癌[3]，腺癌是常见的组织学类型[4]。国外学者较早通过小脑延髓池（cisterna magna,CM）穿刺进行脑膜癌病大鼠模型的实验性研究及鞘内给药方式需要较复杂的操作过程[5]。本实验通过对脑膜癌病动物模型的实验方法进行改进，旨在建立操作简单、重复性较好的脑膜癌病小鼠模型，为进一步探讨脑膜癌病发病机制及评估相关治疗药物的有效性及安全性提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 清洁级C57BL/6小鼠，雌性，6～8周，体质量17～21 g。实验小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。雌性C57BL/6小鼠35只，其中20只随机分为对照组和实验组，每组10只，分别经小脑延髓池注射PBS或Lewis肺癌细胞悬液，观察评估注射后两组小鼠行为学表现；15只随机分为正常对照组（n=3）、PBS 组（n=6）和模型组（n=6），当小鼠症状表现明显时，切片进行软脑（脊）膜病理HE染色。

1.2 实验细胞及培养 小鼠Lewis肺癌细胞株（Lewis lung carcinoma cell line,LLC）购自中国科学院干细胞库。LLC用含10%胎牛血清的DMEM培养基 （添加青霉素100 U/mL，链霉素100μg/mL）置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。实验时取对数生长期细胞。

1.3 小鼠小脑延髓池注射法 首先腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉小鼠。小鼠取俯卧位，在其颈部下面垫一个10 mL注射器针筒，使小鼠头部和躯干形成约120°角度（图1 A）。剪掉小鼠颈背部毛，75%酒精局部消毒，在两耳后部连线处做一皮肤中线切口，清晰暴露颈背部中线（图1 B）。左手拇指、食指轻柔固定小鼠头部，右手持25μL尖头微量进样器，针尖倾斜约45°，沿颈背部中线从枕外隆凸与第一颈椎之间的间隙穿刺，有较明显落空感表明针尖已进入小脑延髓池，进针深度约 4 mm（图 1 C），然后缓慢（3 μL/min）注射备好的 LLC 细胞（图 1 D）悬液（2×107mL-1，实验组）或无菌PBS（对照组）7.5μL。注射完毕后，针头在原位留置约30 s，之后拔出针头，消毒，将小鼠放回笼内。模型制备前期，可先将小鼠麻醉，经小脑延髓池缓慢注射10μL稀释的墨汁溶液，之后解剖小鼠脑及脊髓，可见墨汁溶液主要分布于小脑延髓池、腹侧脑池（图2），提示穿刺注射成功。模型制备过程中，实验组死亡2只，对照组死亡1只，均按实验分组依次补齐，进行统计学分析。

图1 小鼠小脑延髓池注射方法示意图。 A-C：小鼠小脑延髓池注射过程示意图；D：显微镜下 LLC细胞形态（40×10，比例尺50 μm）

1.4 小鼠体质量的测量 小鼠行小脑延髓池注射当天记为day 0，以后每24 h，即每天早8:00～9:00称取小鼠体质量，并记录实验组及对照组小鼠体质量随时间变化情况。

1.5 小鼠神经系统症状表现的评估 小鼠体质量下降超过10%，并且出现以下表现之一可认为是出现神经系统症状表现：①小鼠活动明显减少，全身状态差；②小鼠出现弓背姿势；③小鼠步态不稳，行走缓慢；④将小鼠尾巴拎起，小鼠出现旋转运动。

图2 墨汁溶液经小脑延髓池注射后分布于小鼠蛛网膜下腔。A：可见墨汁溶液分布于小脑延髓池部位（箭头所示）；B：墨汁溶液分布于腹侧脑池

1.6 石蜡切片HE染色 小脑延髓池注射LLC细胞后，观察至实验组小鼠出现症状表现如消瘦、明显虚弱、全身状态差且症状进行性加重时，4%多聚甲醛灌注固定，待小鼠尾巴及四肢僵硬后，取脑及脊髓组织，同时取材对照组。固定后的标本经脱水、透明、浸蜡及包埋后，制成蜡块。Leica RM2235石蜡切片机切片，厚度为5μm，切片经脱蜡后进行常规HE染色。

1.7 统计学分析 应用SPSS21.0进行数据分析，结果数据服从正态性及方差齐性者，计量资料的统计描述采用均数±标准差（x±s）表示，两组间均数的比较采用两独立样本t检验。数据不满足正态性或方差齐性者，计量资料的统计描述采用M（QL，QU）表示，两组间均数的比较采用两独立样本Wilcoxon秩和检验。两组生存曲线差异的比较采用log-rank检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠体重变化情况及生存期 小脑延髓池注射前对照组小鼠体质量为（18.68±1.08）g，实验组小鼠体质量为（19.43±0.86）g，两组比较差异无统计学意义（t=1.729，P=0.101）。小脑延髓池注射后第1天，两组小鼠体重均下降明显，对照组小鼠体质量为 （17.02±1.63）g，实验组小鼠体质量为（17.08±1.06）g，两组比较差异无统计学意义 （t=0.101,P=0.921）。第2～3天，两组小鼠体质量水平仍较低， 分别为 （17.02±1.67）g，（16.59±1.09）g；（17.21±1.49）g，（16.93±1.08）g；t依次为-0.692，-0.409，均 P＞0.05），较前变化不大。第 4～10 天，两组小鼠体质量均缓慢回升，两组比较差异无统计学意义（t/Z 值依次为-0.081，-0.594，-0.302，-0.676，-1.058，-1.086，-1.589，均 P＞0.05）。第 11～37 天，对照组小鼠体质量仍在逐渐增长，而实验组小鼠体质量开始进行性下降直至死亡，两组比较差异具有统计学意义（t依次为-2.378，-4.794，-3.78，-8.283，-8.462，-9.798，-8.258，-6.981，均 P＜0.05）。 见表1、图3 A。实验组小鼠均在40 d内死亡，中位生存时间为32.5 d，而对照组小鼠均至观察终点40 d仍存活，log-rank 检验（χ2=21.03，P＜0.05），差异具有统计学意义（图3 B）。

2.2 小鼠神经系统症状表现 实验组小鼠小脑延髓池注射LLC细胞后症状出现在第10～16天，平均为(13±2)d。全部实验组小鼠表现为活动明显减少，全身状态差；其中6只小鼠病程中出现了弓背姿势；5只小鼠出现步态不稳；2只小鼠出现拎起尾巴旋转的表现。而对照组小鼠均活动正常，未出现上述异常表现。

表1 两组小鼠体质量（g）变化

图3 小脑延髓池注射LLC细胞悬液或PBS后两组小鼠体质量变化情况及生存曲线。A：注射后第11天，与PBS对照组相比，实验组小鼠体质量开始明显下降，*P＜0.05；B：两组小鼠生存曲线比较

2.3 组织病理学HE染色分析模型小鼠肿瘤浸润脑膜情况 小脑延髓池注射LLC细胞后，模型组小鼠症状表现明显时（即出现明显消瘦、虚弱、全身状态差或出现弓背姿势等表现时），脑及脊髓组织病理HE染色结果显示肿瘤细胞浸润软脑膜，以脑基底部及脊髓颈段多见。正常对照组及PBS组小鼠软脑膜未见明显异常。见图4。

3 讨论

目前脑膜癌病的治疗效果不理想，为进一步探索相关治疗靶点，以及评估相关治疗药物及方法的有效性及安全性，首先需要建立稳定的实验动物模型，为后续研究提供基础。LLC细胞是小鼠来源的肺腺癌细胞，来源于C57BL荷瘤小鼠，广泛应用于小鼠移植瘤模型中，有文献报道LLC细胞能够在脑脊液中生长[6]。 因此，本实验采用LLC细胞株及C57BL/6小鼠进行疾病模型的实验建立。

REIJNEVELD等[7]描述了一种重复性较好的、经小脑延髓池穿刺而建立的黑色素瘤脑膜癌小鼠模型，可进行重复鞘内给药干预，适于评估一些新治疗方案（包括基因治疗）的有效性及毒性作用。但需要实验者准确触摸并定位穿刺点。CHEN等[8]研究中，小鼠小脑延髓池注射时通过做颈背部中线皮肤切口，准确暴露穿刺点，从而一定程度上避免了穿刺的盲目性。本实验中，综合上述实验方法并加以改进，主要是在小鼠颈部下面垫一个10 mL注射器针筒，使小鼠头部和躯干形成约120°角度，便于倾斜进针；并做一皮肤中线切口，暴露颈背部中线，沿颈背部中线寻至颅骨枕外隆凸，贴着枕骨骨面倾斜进针，即与第一颈椎间隙进针，穿刺点清晰可辨；有较明显落空感表明针已进入小脑延髓池，距针尖约4 mm处设置一小橡胶塞，防止进针过深伤及小鼠脑干，造成实验小鼠死亡；注射完毕后针头原位留针约30 s，减少注射液渗出。

图4 不同处理组小鼠脑和脊髓组织HE染色。 A-B：分别为正常对照组、PBS组小鼠脑组织，软脑膜未见异常；C-D：模型组小鼠中脑背侧脑膜可见肿瘤细胞浸润（HE×40，HE×200）；E-F：模型组小鼠延髓背侧脑膜可见弥漫肿瘤细胞浸润 （HE×40，HE×200）；G-H：模型组小鼠颈髓软脊膜可见局灶肿瘤细胞浸润（HE×40，HE×200）（C、E、G 比例尺 200 μm，A、B、D、F、H 比例尺 50 μm）

脑膜癌病常发生于恶性肿瘤晚期阶段，肿瘤细胞转移至脑脊液，并可迅速播散到整个中枢神经系统，浸润脑、脊髓、颅神经和/或脊神经，引起严重的神经功能障碍甚至死亡[3,9]。文献报道脑膜癌病模型大鼠或小鼠症状常表现为体重下降[7,10]，明显虚弱，全身状态差[5,7,10]，步态不稳[5]，肢体瘫痪[5]，弓背姿势[10]，拎起尾巴时小鼠出现旋转运动[10]等。本实验采用LLC细胞经小脑延髓池穿刺注射C57BL/6小鼠而建立疾病模型。注射后第1～10天，两组小鼠体质量均先下降后逐渐回升，考虑麻醉、手术操作等有创损伤后小鼠体质量下降，随后处于恢复期小鼠体质量回升。至第11天，对照组小鼠体质量仍在逐渐增长，而实验组小鼠体质量开始进行性下降直至死亡，考虑可能与疾病进展、肿瘤消耗等相关。实验组小鼠症状出现时间平均为（13±2）d，主要表现为活动明显减少，全身状态差，部分小鼠病程中出现了弓背姿势、步态不稳及拎起尾巴旋转的表现，与文献报道基本一致。

组织病理学研究表明，脑膜癌病患者肿瘤细胞浸润蛛网膜下腔，病灶多见于脑基底部及脊髓下段，马尾部位较常见[3]。动物实验中，模型鼠脑膜及脊膜的病理改变与脑膜癌病患者类似，显微镜下多可见肿瘤细胞浸润脑基底部及马尾，可能与肿瘤细胞随脑脊液循环而易于粘附、沉积此处相关。本实验模型小鼠脑及脊髓组织切片HE染色结果显示肿瘤细胞弥漫或局灶浸润软脑膜、蛛网膜下腔，以脑基底部及脊髓颈段为主，可能由于这些部位接近注射部位，亦或肿瘤细胞易于粘附、沉积。考虑可通过增加注射细胞悬液体积至10μL（文献报道小鼠可耐受），细胞数不变，从而一定程度稀释所注射的细胞悬液，使得肿瘤细胞更易随脑脊液循环而播散；或通过注射后改变小鼠体位，如人为将小鼠立起一定时间，使得所注射细胞悬液更易于随脑脊液循环。此外，本实验选择小鼠症状表现明显时取材，该病理表现亦可能与取材时间相关，应进一步于接种肿瘤细胞后不同时间点分别取材研究其病理改变的动态变化，从而更好了解模型小鼠疾病的病理变化。