pVAX1-IL4／SYN-B核酸疫苗对鱼藤酮慢性帕金森病小鼠的治疗作用☆

杨旭 杨云鹏 马英 周长青 张玉平 陈中美 彭国光

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是中老年常见的神经系统变性疾病，以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易（Lewy）小体形成为特征。Lewy小体的主要成份是异常聚集的 α⁃突触核蛋白（α⁃synuclein，α⁃syn）。 近年来的研究表明，α⁃syn 在 PD发病中起了极其重要作用［1］，α⁃syn蛋白异常聚集是PD病理和发病的中心环节［2］，α⁃syn异常聚集可能通过诱导多巴胺能神经元发生凋亡这一机制参与 PD 的发生［3］，因此以 α⁃syn为靶点进行 PD防治研究是极具前景的研究方向［4-5］。我们课题组以降解和清除致病性异常聚集的α⁃syn蛋白，降低细胞免疫所引起的炎症反应为出发点，成功优化构建了人 α⁃syn（hα⁃syn）核酸疫苗（pVAX1⁃IL4／SYN⁃B），并在哺乳动物细胞内高效表达［6］。本研究旨在观察hα⁃syn 核酸疫苗（pVAX1⁃IL4／SYN⁃B）免疫对鱼藤酮慢性PD小鼠行为学和神经病理改变的影响，以及神经保护作用和治疗效果，为今后进一步探索核酸疫苗防治PD的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人 α⁃syn 质粒疫苗pVAX1⁃IL⁃4／SYN⁃B核酸疫苗是由带有细胞因子IL⁃4及剔除了T细胞表位、然后将B细胞表位融合而得的真核表达载体，已经由本实验室成功构建和制备，真核表达载体pVAX1是由Invitrogen公司购进，大肠杆菌TOP10是本实验室保存的宿主菌。

1.1.2 实验动物 清洁级C57BL／6小鼠，健康雄性，6～8周龄，体质量20～22 g，重庆医科大学实验动物中心提供。喂养条件：每日光照12 h，黑暗12 h，室温设为常温，任意摄取水食。实验全过程对动物的喂养与取材均遵守实验动物管理与保护的有关政策和规定。

1.2 方法

1.2.1 质粒的大量制备及纯化 首先按照GenE⁃lute HP去内毒素核酸大量纯化试剂盒 （Sigma，美国）说明书的步骤，抽提去内毒素质粒的pVAX1和 pVAX1⁃IL⁃4／SYN⁃B 两种质粒，然后用分光光度计测定A260／A280的比值。A260／A280全在1.8-2.0之间，为纯度符合要求。最后用无菌去离子水稀释，配伍成浓度为 1 μg／1 μL。 贮于⁃80 ℃备用。

1.2.2 鱼藤酮慢性帕金森病小鼠模型的建立 参考万金城等［7］文献的模型制作鱼藤酮慢性帕金森病小鼠模型，取所有健康雄性C57BL小鼠背部皮下注射鱼藤酮（Sigma，美国）1mg／kg（配制方法∶二甲基亚砜∶鱼藤酮∶生理盐水 =3.5 L∶1 g∶0.5 L），1 次 ／d，连续地注射 40 d。

1.2.3 实验动物的免疫接种 造模成功后的小鼠随机分为核酸疫苗组、空质粒组、PBS对照组共3组分别进行疫苗注射。所有模型动物在每次治疗前均在双侧后肢胫骨前肌部位进行分别注射0.5%布比卡因 50 μL，于注射72 h后，分别对应在各组小鼠同样深度同样部位多点注射 pVAX1⁃IL⁃4／SYN⁃B、空质粒 pVAX1、 PBS 溶液各 100 μL，共 3次，每次间隔3周。

1.2.4 观察小鼠行为学的变化 采用自由活动实验（Open⁃fild test）［8］密切观察各组小鼠疫苗注射后行为学的变化。自制透明玻璃箱30 cm×30 cm×15 cm，箱底划为6 cm×6 cm的格子，在安静光线较暗的环境中检测。小鼠适应环境10 min后，计数5 min内小鼠移动的格子数和站立的次数，连续测5次取平均值。

1.2.5 小鼠中脑黑质 α⁃syn和 TH变化的观察常规蜡片脱蜡至水，微波热修复抗原后，PBS冲洗，3%的H2O2去除内源性过氧化物酶；PBS冲洗，正常山羊血清封闭，室温孵育15 min；相继滴加特异性第一抗体 ：α-syn 一抗（abcam）1∶250 稀释，TH一抗（北京博奥森试剂）1∶100稀释 ，然后过夜；第二天复温1 h，PBS冲洗后滴加生物素标记的山羊抗兔 IgG二抗工作液，37℃水浴孵育 15 min；PBS冲洗后再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37℃孵育 15 min；然后 PBS冲洗，进行 3，3－二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，盐酸乙醇分色。梯度脱水和酒精透明，最后封片。采用Image-Pro Plus软件进行图像分析，进行黑质致密部α-syn积分光密度值（integral optical density）的测量及计数黑质致密部TH阳性神经元数目。

1.2.6 RT-PCR检测黑质 α-syn的表达 按 Trizol试剂盒 （TaKaRa公司）说明书提取小鼠脑黑质总RNA，进行分光光度计鉴定RNA样品，按照RTPCR试剂盒说明书在PCR仪（美国Bio-Rad）上进行RT-PCR。RT的反应条件设为30℃10 min，85℃15 s。GAPDH 引物：下游 5′-GTGGAAGAATGGGAG T TGCTGT3′，上游 5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG TCT3′，扩增产物为 610 bp；α-syn 引物：下游 5′-AG GCTCATAGTCTTGGTAGC-3′，上游 5′-CATGAAAG GACTTTCAAAGG-3′，扩增产物为 403 bp；；反应的条件：预变性温度为94℃5 min；变性温度为94℃，进行30 s退火温度为56℃，进行30 s，延伸温度为72℃，进行 60 s，一共30个循环；最后 72℃再延伸7 min。采用Quantityone4.6图像分析软件进行照相分析。每个条带的相对光密度值为目的条带光密度值／内参GAPDH条带光密度值。

1.2.7 统计学方法 采用 SPSS 16.0软件包进行数据分析，数据采用（）表示，多组间比较先进行方差齐性检验，若方差齐者进行方差分析，若方差不齐者进行秩和检验，两组比较进行LSD-t检验。检验水率α＝0.05。

2 结果

2.1 行为学观察 与对照组比较而言 ，核酸疫苗组小鼠的对外界刺激反应慢，自发性活动减少，爬行活动减慢，体重减轻等类帕金森病症状改善；核酸疫苗组与空质粒组及PBS对照组相比其自由活动移动格子数及站立次数明显改善，并有统计学意义（P＜0.05），然而空质粒组及 PBS对照组比较无统计学意义（P﹥0.05，见表 1）。

2.2 免疫组化检测结果

2.2.1 中脑黑质 TH阳性细胞的改变 空质粒组和PBS对照组中脑黑质TH阳性细胞质染色较浅，突起较少，细胞数明显减少，两组间没有统计学意义 （P＞0.05），核酸疫苗组较空质粒组和PBS对照组TH阳性细胞增多，染色加深；TH阳性细胞数比空质粒组、PBS对照组增加了51.43%、59.00%，且有统计学意义（P ＜ 0.05，见表2及图 1）。

2.2.2 中脑黑质 α-syn表达的改变 各组小鼠黑质均可见深染，棕黄色的α-syn阳性表达。核酸疫苗组与空质粒组及PBS对照组比较，首先小鼠中脑黑质部α-syn阳性神经突起染色较淡，其次积分吸光度值减少45.64%、43.28%，且差异有统计学意义（P＜0.05）。而空质粒组及PBS对照组中脑黑质部α-syn的积分吸光度值差异无统计学意义（P＞0.05），这就充分表明核酸疫苗组α-syn表达较对照组有所减少（见表2及图2）。

表1 核酸疫苗组与对照组小鼠行为学评价

表2 核酸疫苗组与对照组小鼠黑质区TH阳性细胞数及α－突触核蛋白的积分吸光度值改变

图1 小鼠黑质部位TH免疫组织化学染色（400×）

图2 小鼠黑质部位α⁃syn免疫组织化学染色（400×）

图3 小鼠脑黑质α⁃syn的 mRNA表达

2.3 RT-PCR检测α-syn mRNA的表达 核酸疫苗组小鼠中脑黑质致密部α⁃syn mRNA表达水平（0.37±0.17）较空质粒组（0.80±0.01）及 PBS对照组（0.74±0.05）明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。空质粒组和PBS对照组相比，差异无统计学意义（P ＞ 0.05，见图 3）。

3 讨论

实验结果表明，pVAX1⁃IL⁃4 ／SYN⁃B 核酸疫苗能改善帕金森病小鼠行为学症状，减轻鱼藤酮神经毒素对多巴胺神经元的损害和阻止多巴胺神经元的进一步损害，有效清除异常聚集的α⁃syn，起到神经保护作用。

万金城等［7］研究证实，慢性鱼藤酮中毒可诱导小鼠发生PD样行为学和病理学改变，导致中脑黑质TH阳性神经元减少，α⁃syn表达增高和聚集。本研究采用 pVAX1⁃IL4／SYN⁃B核酸疫苗免疫鱼藤酮慢性帕金森病小鼠，结果显示核酸疫苗组与空质粒组及PBS对照组比较，小鼠中脑黑质部α⁃syn积分吸光度值减少 45.64%、43.28%，同时通过RT⁃PCR检测发现核酸疫苗组小鼠中脑黑质致密部α⁃syn mRNA表达水平较对照组明显减少，这充分表明 pVAX1⁃IL⁃4／SYN⁃B 核酸疫苗可能通过增加α⁃syn的降解来有效清除α⁃syn的异常聚集。通过自由活动实验观察到，优化人α⁃syn核酸疫苗能有效改善小鼠类帕金森病症状；而且核酸疫苗组小鼠黑质TH阳性细胞数比空质粒对照组、PBS对照组增加了51.43%、59.00%，这说明pVAX1⁃IL4／SYN⁃B核酸疫苗能阻止黑质致密部多巴胺能神经元进一步损害。2005年，Masliah等［9］首次采用α⁃syn重组蛋白疫苗免疫帕金森病转基因小鼠，产生抗体可通过溶酶体途径清除α⁃syn，减少α⁃syn在DA能神经元胞体和突触的聚集。这与我们实验一致。目前对α⁃syn降解的具体机制尚不清楚。

我们课题组先期实验成功地构建了hα⁃syn核酸疫苗 pVAX1⁃hαS1⁃140，并在哺乳动物体内表达［10］。以后的试验观察到hα⁃syn核酸疫苗治疗MPTP慢性帕金森病模型小鼠取得了较好疗效，使α⁃syn蛋白表达减少约39%，TH阳性细胞数增多46%～55%［11］。但是免疫治疗可能激发有害的炎症反应。正是考虑到核酸免疫治疗可能带来有害的炎症反应，为提高核酸疫苗的免疫原性，减轻或避免细胞免疫应答，促进体液免疫，我们课题组对核酸疫苗进行了优化，删除α⁃synuclein基因中的毒性片段T细胞表位，同时加入细胞因子人 IL⁃4基因为免疫佐剂，构建多表位核酸疫苗pVAX1⁃IL⁃4 ／SYN⁃B［6］。 赵臣勇等［12］的研究证实 pVAX1⁃IL⁃4／SYN⁃B可在一定程度上减轻小鼠黑质部炎症反应，对多巴胺能神经元有一定的保护作用。本实验 pVAX1⁃IL⁃4／SYN⁃B 核酸疫苗对多巴胺能神经元的保护程度及降解α⁃syn的能力优于王少君等［12］的实验，这是由于本实验采用的优化后的核酸疫苗在一定程度减少了免疫炎症反应，从而提高了其免疫作用。

总之，优化 hα⁃syn 核酸疫苗（pVAX1⁃IL⁃4／SYN⁃B）能改善帕金森病小鼠行为学症状，减轻鱼藤酮神经毒素对多巴胺神经元的损害，达到阻止多巴胺神经元进一步损害的目的，清除异常聚集的α⁃syn起到神经保护作用，具有广阔的开发应用前景。但是，如何在提高免疫效果的同时，进一步消除可能的炎性反应，核酸疫苗清除异常聚集的α⁃syn的具体机制仍是我们今后的研究方向和重点。

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