运动预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠自噬相关蛋白表达及心肌细胞凋亡的影响

李宏玉，张继瑶，张钰，张世强，黄慧琳，李佳帅，唐强

1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨市 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨市150040

急性心肌梗死后，通过溶栓或冠状动脉介入治疗及早恢复心肌灌注，能减小心肌梗死面积，改善临床症状，但缺血心肌血流恢复可能引起心肌再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[1-2]。心肌缺血后自噬活动增强，心肌缺血再灌注阶段自噬被过度激活，进一步加重心肌损伤；在自噬过程中，Beclin 1 发挥着正向调控作用，是调控自噬的关键靶点之一。微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)是反映细胞自噬激活与否的标志，尤其是LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ[3-5]。当前研究表明，运动预处理可降低MIRI，产生类似缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)的保护效应[6-8]，已成为当前运动心脏康复的研究热点之一。

本文拟从细胞自噬的角度探讨运动预处理防治心肌缺血再灌注损伤的可能机制，为其临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级健康成年雄性Sprague-Dawley 大鼠，体质量(230±10) g，购于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，动物使用许可证号SYXK(黑)2016004。适应性饲养1 周，温度(25±2) ℃、湿度(50±5)%，通风良好，光照12 h/12 h 明暗交替，自由食水。分组前给予适应性训练1周，剔除不合格的大鼠。

选择合格大鼠36 只，随机数字表法分为假手术组、模型组和运动预处理组，每组12 只。假手术组、模型组不进行任何干预，仅正常抓取。运动预处理组给予4周运动预处理训练。

实验过程中的动物饲养及取材严格遵循国家实验动物管理条例及实施细则。

1.2 主要试剂与仪器

BCA 蛋白浓度测定试剂盒：北京SOLARBIO 公司。SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒：美国BIOSHARP 公司。Beclin 1 多克隆抗体、LC3 多克隆抗体：美国SIGMA 公司。TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒：北京中杉金桥生物技术公司。-80 ℃超低温冰箱：日本PANASONIC 公司。BioNex 台式多导生理信号记录仪：美国MINDWARE 公司。R407 小动物呼吸机：深圳瑞沃德公司。ZH-PT 型动物实验跑台：徐州利华电子公司。Experion全自动电泳系统：美国BIO-RAD公司。

1.3 运动预处理方案

参考Bedford等[9]预实验设计中等强度跑台运动训练方案：0°倾斜，18 m/min，电击强度1.0 mA，连续40 min，每周训练5 d，共4周。

适应性训练方案：0°倾斜角，运动速度从第1 天的11 m/min 逐渐递增，至第5 天为15 m/min，电击强度1.0 mA，连续训练40 min。

1.4 大鼠心肌缺血再灌注模型制备

腹腔注射10%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，仰卧位固定，多导生理信号记录仪监测心电，颈部及左前胸剃毛，纵行切开颈部皮肤，软组织钝性分离暴露气管，连接动物呼吸机以进行机械通气；待大鼠呼吸平稳后于胸骨正中偏左0.5～1 cm 做一纵形切口，逐层分离肌层，剪开3～4 肋间，充分暴露心脏后，定位左冠状动脉前降支，用4-0 带线缝合针于前降支起始段2～3 mm 处进针，肺动脉圆锥旁出针，深1～1.5 mm，结扎处放置一乳胶管，方结结扎，即刻将心脏原位送回，轻轻挤压胸腔排出空气并关闭胸腔以防止气胸，将结扎线尾端留在胸外[10]。以ST 段抬高及左室前壁向外膨胀发绀为结扎成功的标准。30 min 后松开结扎线，再灌注1 h 后取材。左室前壁缺血区紫色消失，抬高的ST段下降1/2以上为造模成功。

假手术组在左前降支仅穿线但不予结扎。

1.5 Western blotting

再灌注1 h后，各组取6只大鼠，迅速采集结扎线以下心肌组织，生理盐水充分洗净，放入液氮内，保存于-80 ℃冰箱。取一定量的心肌组织，提取总蛋白30µg，10%SDS-PAGE 电泳；转印至PVDF 膜，缓冲液浸泡，室温封闭；加入Beclin 1 多克隆抗体(1∶1000)、LC3 多克隆抗体(1∶500)，4 ℃孵育过夜；加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔lgG(1∶5000)，室温孵育60 min，显色3 min，凝胶成像系统拍照、观察。采用Bio-Rad 图像分析软件计算Beclin 1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白灰度值与内参GAPDH蛋白灰度值之比。

1.6 TUNEL染色

再灌注1 h后，各组取6只大鼠，迅速采集结扎线以下心肌组织，生理盐水充分洗净，10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，抗原修复，脱蜡，透化，PBS 漂洗。配制TUNEL 反应液，按照试剂盒说明书操作；每只大鼠取3 张切片，每片镜下(40×10)取缺血区5 个视野，采用Image Pro Plus 6.0 记录每个视野中凋亡细胞数、总细胞数。计算心肌细胞凋亡指数。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件对全部数据进行处理，计量资料以(±s)表示。各组间比较采用ANOVA 单因素方差分析，LSD-t检验比较两两之间差异。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Western blotting

假手术组Beclin 1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白基础表达。与假手术组比较，模型组、运动预处理组心肌缺血区LC3-Ⅰ蛋白表达下降(P＜0.05)，Beclin 1、LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ上升(P＜0.05)。与模型组相比，运动预处理组心肌缺血区LC3-Ⅰ蛋白表达上升(P＜0.05)，Beclin 1、LC3-Ⅱ蛋白表达及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低(P＜0.05)。见表1、图1。

图1 各组心肌缺血区Beclin 1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达

2.2 TUNEL染色

假手术组仅见极少量TUNEL 阳性表达。与假手术组相比，模型组、运动预处理组心肌缺血区凋亡细胞指数增加(P＜0.05)；与模型组比较，运动预处理组心肌缺血区凋亡细胞指数减少(P＜0.05)。见表2、图2。

表1 各组心肌缺血区Beclin 1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表达

表2 各组心肌缺血区细胞凋亡指数

3 讨论

缺血性心脏病是目前威胁人类健康的重要疾病之一。线粒体损伤、氧化应激、自噬等是心肌缺血及损伤的重要分子机制。循证医学证据表明，以运动训练为基础的康复方案可提高缺血性心肌病患者的生活质量，降低再住院率和远期死亡率[11-12]。运动训练可延缓左心室重塑，促进心脏血管舒张及微血管再生，增强心肌收缩能力，抑制缺血再灌注损伤导致的心律失常等，实现对梗死心脏的保护作用[13-14]。缺血前运动训练的保护作用与运动诱导心肌细胞适应性保护有关。

细胞自噬是指在营养缺乏、氧化应激/感染等外源性刺激下，细胞将自身变性的蛋白或受损的细胞器包裹进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autophagy lysosome,AL)，降解其所包裹内容物的过程，借此实现细胞本身的代谢和更新[15-16]。正常情况下，心肌细胞自噬维持在较低的水平。缺血缺氧状态时，细胞的自噬水平上调，再灌注期间自噬可被诱导进一步增强[17-18]。Matsui 等[19]发现，心肌缺血期间自噬起保护作用，再灌注期间加重心肌损伤。

自噬相关蛋白LC3 的表达水平可代表自噬体和溶酶体的数量。LC3 主要分为Ⅰ型和Ⅱ型。生理状态下，细胞内合成的LC3会被加工成为LC3-Ⅰ。自噬激活后LC3-Ⅰ表达下降，LC3-Ⅱ形成且表达量上升，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ是目前判断自噬水平高低的主要标准[20]。在经典自噬通路Beclin 1 信号通路中，Beclin 1基因正向调控自噬，还可调节细胞自噬与凋亡之间的平衡[21]。

细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤重要机制之一，持续缺血和缺血再灌注损伤均可诱发细胞凋亡，且再灌注抑制细胞坏死但不抑制细胞凋亡[22-23]。自噬和细胞凋亡存在交叉机制，二者具有一些共同调节因子，如自噬基因Beclin 1和细胞凋亡Bcl-2家族。当心肌细胞受损时，细胞凋亡和自噬两种程序都会启动，并且自噬可通过减少促凋亡物质如凋亡诱导因子、细胞色素C等释放，减少心肌细胞凋亡；自噬体包裹受损线粒体，可阻止细胞色素C释放进入细胞质，抑制凋亡小体形成[24]。

运动训练是一种机械性、应激性刺激，适度运动通过适度上调细胞自噬水平，保持细胞内环境稳态；而过度运动则导致过强的自噬活动，反而诱发自噬性细胞死亡[25]。本研究表明，心肌缺血后，大鼠心肌细胞自噬通路被激活，LC3-Ⅰ蛋白表达降低，Beclin 1、LC3-Ⅱ蛋白表达升高。预先给予适度运动训练，细胞自噬水平降低。Chen 等[26]发现，心肌梗死家兔进行4周中等跑台运动，自噬水平下调，与我们的研究一致。本研究还发现，缺血再灌注损伤能够引起心肌细胞凋亡；缺血前运动训练可抑制缺血区心肌细胞凋亡。

综上所述，运动预处理可上调自噬相关蛋白LC3-Ⅰ，下调Beclin 1、LC3-Ⅱ表达，诱导自噬适度发生，抑制心肌细胞凋亡，诱导心肌缺血耐受。其相关信号通路及具体的发生机制仍需进一步研究。

图2 各组心肌缺血区细胞凋亡情况(TUNEL染色，×400)