脊髓损伤恒河猴下肢残留跨步能力的评估

赵璨，魏瑞晗，赵文，季润，饶家声1,，杨朝阳，李晓光,

1.北京航空航天大学生物医学工程高精尖创新中心，北京市 100083；2.北京航空航天大学仪器科学与光电工程学院测控与信息技术系，北京市 100083；3.北京航空航天大学生物与医学工程学院生物材料与神经再生北京市重点实验室，北京市 100083；4.首都医科大学基础医学院神经生物学系，北京市 100069；5.国家康复辅具研究中心人体生物力学实验室，北京市100176

脊髓损伤是中枢神经损伤的一种，它会导致脊髓内长程传导束的断裂，从而引发运动功能部分或完全丧失。由于成年哺乳类动物中枢神经系统的自发恢复能力极其贫乏[1]，因此脊髓损伤导致的运动功能缺失往往是永久且不可逆转的。

研究脊髓损伤最主要的指标是残留运动功能输出的恢复，它能够最直观地反映脊髓损伤的受损程度或治疗效果。其中，非人灵长类脊髓损伤运动评估对于阐明脊髓传入通路的完整性及脑-脊髓结构的作用等方面具有重要意义。有研究通过对非人灵长类在开放场中的运动表现评估脊髓损伤后的下肢/四肢运动输出，从而评估细胞/介入治疗方案的效果[2-3]。然而，这些研究依赖于观察者的主观评估，对运动输出的变化不够敏感和精确。最近的研究开始将双足行走的动物模型引入脊髓损伤后的运动评价中，通过分析双足行走的足迹[4]、足底压力[5]或双足运动的步态[6-8]来反映动物在脊髓损伤后的运动功能变化。其中，步态分析方法能够通过大量参数获得更为准确、客观的步态特征，进而展现中枢神经损伤对步态特征的影响，因此在脊髓损伤后的运动评估中具有显著优势。

另一方面，步态分析在临床研究中已被广泛用于评估由神经系统疾病所导致的步态异常或运动障碍，为分析步态异常的原因和制定治疗/康复的方案提供实验依据[9]。基于此，从非人灵长类双足运动的评估中得到的步态数据在向临床应用转化。

本研究采用步态分析方法纵向评估恒河猴在脊髓损伤前及损伤后6 周和12 周时的步态表现，获取不同时间点的步态特征并进行分析，探索脊髓部分损伤后非人灵长类双下肢运动功能随时间的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性成年恒河猴4 只，体质量(5±1)kg，年龄4～6岁，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验流程经过首都医科大学实验动物福利与伦理委员会的审核批准。

1.2 运动训练范式

所有恒河猴在正式实验前均进行适应性训练3次，在跑步机上完成约束条件下的双足跨步运动，每周1次。实验动物被保定于特制的固定装置上，双足站立于静止的跑步机上，适应10～20 min 之后开始跨步运动。训练过程采用正反馈机制让动物学习移动双下肢来完成行走。跑步机速度0.8 km/h。如果恒河猴能够连续行走10 步以上就给予果汁奖励，连续完成10 次10步以上的跨步行走即可完成当次训练。

1.3 脊髓损伤手术

恒河猴脊髓半侧移除模型由专业外科医生执行，无菌环境下完成。术前肌肉注射盐酸氯胺酮注射液10 mg/kg 诱导麻醉，随后肌肉注射盐酸塞拉嗪溶液5 mg/kg 维持麻醉，术中静脉持续注射氯化钠葡萄糖溶液40 滴/min。暴露胸椎T7-9节段，手术显微镜下切开硬脊膜暴露脊髓，以脊髓中央后静脉作为脊髓中线标志，在右半侧切除脊髓组织1 cm，造成脊髓半侧损伤。术后3～5 d 内，动物肌肉注射头孢唑林30 mg/kg和丁丙诺啡0.15～0.3 mg/kg以预防感染。

恒河猴在标准猴笼中单独饲养，任意获取新鲜蔬果、猴粮及干净的水。所有动物术后均被严格检测，尤其是排尿、排便情况。饲养室内保持温度23～26 ℃、湿度35%～45%。

1.4 步态测试

分别在脊髓损伤前、脊髓损伤后6 周和12 周进行步态测试。步态测试前，恒河猴以与训练期同样的状态被保定于固定装置，随后将荧光标记点固定于双侧髂前上棘、髂后上嵴、大腿、膝关节、小腿、踝关节、足后跟、足趾，共16个点。其中，大腿标记点的位置为大转子到膝关节总长度的上2/3 处，小腿标记点的位置为膝关节和踝关节连线的中点，足趾标记点的位置为足中指第二跖骨关节处，其余标记点均贴于相应骨性解剖位置。采用VICON 系统(Vicon 8,Oxford Metrics Limited,UK)采集下肢步态数据，采集频率为100 Hz。测试中，动物在速度0.8 km/h 跑步机上行走，连续行进＞10步的数据被保留。

1.5 步态数据处理及分析

实验动物进行双足行走时共有6 个红外摄像机进行拍摄，VICON 系统将所有摄像机传回的2D 信号重新整合，构建一个3D 空间并实时记录每个荧光标记点的3D 空间坐标值。同时该系统能够根据各个点的空间位置构建恒河猴下肢的肢体及关节模型(图1)以模拟动物的运动轨迹。根据采集到的所有荧光标记点实时3D 坐标值，计算步态参数，包括步态周期时长、步长、步高、膝/踝关节角度幅值等。

跨步是一个复杂的运动，肢体各节段、关节之间会互相影响，因此各步态参数之间也会相互影响。基于此，将可能存在关联影响的参数设为联动参数，即，步长和步高视为一对联动参数，踝关节屈曲/伸展幅值和膝关节屈曲/伸展幅值视为一对联动参数。

与人类不同，恒河猴为趾行性动物，即迈步时不是足跟落地而是足趾先触地。因此，在本研究中恒河猴的一个完整的步态周期被定义为单侧肢体一次足趾触地到下一次足趾触地的过程。而步态周期时长即动物在跨步过程中单侧肢体从足趾离地到下一次足趾离地所用时长。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 步态协调性

脊髓损伤前，所有动物双足均能完成连续跨步，同时双足间跨步为交替进行，协调性良好。单侧肢体的整个步态周期可以进一步细化为双站立期-单站立期-双站立期-摆动期，与人类步态极大相似。同时每只动物双侧肢体的各个步态周期时长较为均匀，双侧步态稳定。

脊髓损伤后6 周，患侧均没有观察到明显的摆动期，肢体始终处于拖拽状态，无法完成完整的跨步。同时，肢体间的协调性也受到极大影响，两侧肢体没有观察到任何交替步态，患侧肢体是在健侧肢体的带动下被动运动，而非主动迈步。

脊髓损伤后12 周，患侧肢体的运动功能仍然缺失，尽管有部分动物能够偶尔完成不连续跨步，但患侧肢体仍然处于拖拽状态，未观察到明显的摆动期。但双侧协调性较脊髓损伤后6 周有轻微的恢复。见图2。

脊髓损伤前，所有动物的步态周期时长为(1.51±0.07) s，其中站立期(0.89±0.07) s，摆动期(0.62±0.03)s。脊髓损伤后6 周和12 周，步态周期时长均显著增加(P＜0.001)；6 周和12 周间无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 关节角度变化

由于脊髓损伤后患侧肢体始终未完成完整的步态，无法采集到足够的步态参数来进行分析，因此仅对健侧肢体的步态进行分析。

图1 恒河猴脊髓损伤后健侧下肢一个步态周期的3D棍棒模型

图2 恒河猴脊髓损伤前后连续5个步态周期双侧下肢步态协调性

所有恒河猴在健康时期膝/踝关节均呈近似“w”的曲线分布，与人类步行膝踝关节屈曲/伸展变化类似。最大膝/踝关节伸展均出现在摆动期末尾，第二个波峰出现在摆动期起始，而最大膝/踝关节屈曲则出现在摆动期中期，且在站立期中期膝关节屈曲/伸展曲线中能观察到明显的平台期。但与人类相比，由于恒河猴的双足运动呈屈膝屈髋模式，因此其屈曲伸展的幅值较人类更小。脊髓损伤后，恒河猴下肢膝/踝关节整体的屈曲/伸展模式未发生改变，仍然呈类似“w”的曲线分布，但其在摆动期内的曲线变化更为陡峭，波峰波谷更明显，且整体的变化幅值偏大。见图3。

表1 不同时间恒河猴步态周期时长比较(s)

脊髓损伤6 周和12 周，健侧一个完整的步态周期内踝关节和膝关节的屈曲/伸展幅值均显著增加(P＜0.001)，两时间点间无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

2.3 步态参数联动变化

脊髓损伤前后恒河猴健侧步长/步高、膝关节角度变化幅值/踝关节角度变化幅值均无显著性差异(P＞0.05)。但联动参数在脊髓损伤后6 周的数据稳定性明显弱于损伤前，损伤后12周其数据稳定性有一定程度的恢复。见表3。

2.4 步态参数相关性

左侧步态周期时长与步长(r=0.838,P=0.001)、步高(r=0.726,P=0.007)和踝关节角度变化幅值(r=0.766,P=0.004)均呈正相关，踝关节角度变化幅值与步长呈正相关(r=0.627,P=0.029)。膝关节角度变化幅值与其他步态参数不相关(P＞0.05)。

表2 脊髓损伤前后恒河猴健侧踝关节和膝关节的屈曲/伸展幅值比较(°)

表3 脊髓损伤前后健侧恒河猴步态参数联动变化

图3 恒河猴健侧肢体脊髓损伤前后膝/踝关节角度幅值变化

3 讨论

已有众多关于啮齿类动物的研究探索脊髓损伤与运动功能之间的关系以及损伤后运动功能恢复的进程[10-12]，这些研究为脊髓损伤的运动功能评估提供了实验基础。然而，对于啮齿类动物来说，即便是严重的脊髓损伤，其运动功能的高自发恢复率也可能会过度预测残留/新生白质对运动输出的贡献[2]。尤其是将相关研究的结论转化至非人灵长类或人类研究时，其可靠性和安全性均受到一定的制约。

近年来有大量健康非人灵长类运动分析的研究。Goetz 等[13]展示了限制条件下健康非人灵长类双下肢行走的步态模式与人类类似，由连续交替的站立期(单站立期和双站立期)和摆动期构成。本研究4 只恒河猴在脊髓半侧移除术前也都观察到完全一致的步态模式。脊髓损伤后，患侧肢体均无法完成跨步，这是由半侧皮质脊髓束输出中断造成的。健侧肢体虽然能够完成连续步态，但与脊髓损伤前相比，膝/踝关节屈曲伸展的幅值在摆动期内显著增加，提示脊髓损伤后恒河猴能够通过增加膝关节和踝关节的屈曲伸展幅度来完成步态周期。健侧肢体在脊髓损伤后采用这样的跨步策略，可弥补患侧肢体承重能力和摆动缺失所带来的负面影响。还有研究显示[14-15]，当跑步机速度增加时，健康恒河猴的双足运动并不会通过增加步频来适应更高的速度，而是在摆动期时长保持稳定的同时，以膝关节和踝关节屈伸幅度的增加完成更高速的步行，而保持基本恒定的步频。本研究中，在速度不变的情况下，脊髓损伤后恒河猴的健侧肢体同样在保持摆动期基本不变的情况下，摆动期内膝/踝关节的屈曲伸展幅值增加，从而步频降低。提示脊髓损伤后动物的健侧肢体在跑步机上展现出的“步态策略”与健康动物在高速跑步机上所采用的策略一致。通过这种“步态策略”，动物能够获得更为有效的步伐，从而补偿患侧下肢运动功能的不足。

虽然脊髓损伤会导致动物的步态策略发生改变，但关联参数如步长/步高或膝/踝关节屈曲伸展幅值之间的协变性(如变化的程度和趋势)显示高度的稳定性。提示健侧肢体的各个部分(大腿、小腿、足及各个关节等)之间的内在耦合并没有受到损伤的影响，这可能也是健侧下肢在脊髓损伤后仍然能够维持跨步能力的根本原因。这意味着脊髓损伤后，健侧下肢的上层运动控制(脑)并没有受损，并及时根据肢体运动缺失的情况代偿性调整运动策略，以维持残留的运动能力。

有研究报道[17]，双足运动猕猴随着跑步机速度增加而单调增加跨步长度和频率。Ogihara等[18]发现，周期时长随速度的增加而减少，跨步长度增加。本研究中，跑步机速度恒定时，步态周期时长和步长、步高和踝关节角度幅值呈正相关。提示步态周期时长可能是脊髓损伤后的运动学分析中的一个关键性参数。

此外，脊髓损伤后12周，健侧肢体的参数趋于稳定。同时，在脊髓损伤后6 周不能完成任何跨步运动的患侧在12周时也能观察到偶发的不完整步态。这与之前的研究结果[19]相结合，意味着脊髓损伤导致的一系列病理进程(变化/事件)在12周趋于稳定，甚至有一定程度的恢复。运动通路内在的可塑性或残留白质的轴突出芽，新的神经回路的形成[20-21]，脊髓结构之间的连接重组[22]等事件可能均为这一现象做出贡献。然而，潜在的神经生理机制仍需进一步的研究。

本研究还存在一定的局限性。首先，不同于临床美国脊髓损伤协会评分及大鼠BBB评分，步态运动学分析对受试对象的身体状况有一定要求，因此完全损伤或超急性期内的受试对象，以及有其他外伤影响运动的受试对象可能无法完成测试。其次，本研究只选取损伤后6 周和12 周两个时间点进行运动学测试及分析，12周之后由脊髓损伤诱发的功能可塑性和运动恢复可能仍在进行之中，因此需要更为全面且更长时程的研究。最后，本研究使用的是T7-9节段半侧切除的恒河猴模型，未来应选取更为接近临床的挫伤模型或介入治疗模型进一步研究。