丰富环境对缺血性脑卒中小鼠海马区Bcl-2和Bax蛋白表达和认知功能的效果

王传杰，吴毅，陶峰，杨雷

1.复旦大学附属金山医院康复科，上海市 201508；2.复旦大学附属华山医院康复科，上海市200040

脑卒中是全球致残和死亡的第二大原因[1]，临床治疗手段较少，临床应用有很大局限性[2-6]，大部分患者遗留各种后遗症，其中相当部分有认知功能障碍[7]。

丰富环境被证明可以改善人类的认知功能损伤[8]，但作用机制尚不清楚。细胞凋亡是一个复杂过程，Bcl-2 家族在其调控中起重要作用，其中Bcl-2 抑制细胞凋亡，Bax 则促进细胞凋亡，Bcl-2/Bax 复合体可以调控细胞死亡过程[9]。本研究复制小鼠永久性左侧大脑中动脉闭塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)，观察丰富环境干预对小鼠认知功能，以及海马区Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级成年雄性C57BL/6小鼠50只〔上海杰思捷实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2018-0004〕，其中42只接受pMCAO手术，8只为假手术组。

1.2 造模与分组

参照相关文献构建小鼠pMCAO 模型[11]。术后经评定，32只造模成功。将造模成功的小鼠按随机数字表法分为标准饲养组(n=16)和丰富环境组(n=16)。假手术组小鼠仅分离左侧颈总动脉，不插入线栓。

所有操作符合复旦大学动物保护与使用委员会的实验操作规范。

1.3 丰富环境与标准环境的构建

术后3 d，假手术组和标准环境组全天置于标准环境笼中饲养，丰富环境组全天置于丰富环境笼中饲养，共21 d。

参照以往文献设置丰富环境鼠笼[10]：65×75×25 cm，含攀登梯、塑料管道、转轮、小盒子等，每笼饲养8～10 只小鼠，笼内物品每3 天更换一次。标准环境(standard environment，SE)鼠笼：21×27×16 cm，仅放置鼠粮、水、垫料。均提供12 h 昼夜光变化，自由进食进水，室温(23±2)℃，湿度56%。

1.4 Morris水迷宫实验

干预后，各组取8只小鼠行Morris水迷宫实验[12]。所有实验均在安静环境中进行。水迷宫为直径150 cm的圆形水池，分成4 个象限(STOELTING 公司)。水温20～22 ℃。10 cm2隐蔽圆形平台位于东北象限，没入水下0.5～1.0 cm。

包括两个评估：空间学习能力实验和空间记忆能力实验。空间学习能力实验连续进行5 d，每天4 次，分别从东南、南，西北、西4 个方向入水。如果小鼠在60 s 内未到达平台，则将其引导到平台。小鼠到达平台后，在平台停留15 s。记录各组逃避潜伏期。第6 天行空间记忆能力实验。从游泳池中取出平台，让小鼠自由游泳60 s，系统自动记录小鼠在目标象限内游动的时间和距离，以及小鼠穿过原平台区域的次数。

1.5 Western blotting[13]

干预后，另8 只小鼠断头取脑，取左侧完整海马组织。提取海马区蛋白。蛋白裂解液裂解，4 ℃、14000 r/min 离心30 min，取上清。BCA 试剂盒(PIERCE 公司)检测蛋白浓度，95～100 ℃10 min。取蛋白样品20 μl，10%SDS-PAGE 凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜(GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 公司)。室温封闭液(上海碧云天生物技术有限公司)中封闭1 h，加入Bcl-2 (1∶1000，ABCAM 公司)、Bax (1∶1000，ABCAM 公 司)和β-tubulin (1∶1000，SANTA CRUZ公司)一抗，4 ℃隔夜孵育。TBST洗涤3次，室温加入IgG 二抗(1∶5000)孵育60 min。Image J测定各条带相对光密度。

1.6 免疫荧光染色[14]

取小鼠大脑切片，室温下4%多聚甲醛固定10 min，10% BSA 封闭60 min。分别加入Bcl-2 (1∶200，ABCAM 公 司)和Bax (1∶200，ABCAM 公 司)一 抗，4 ℃湿盒过夜。PBS 冲洗3 次，加荧光偶联IgG 二抗(1：2000，ABCAM 公司)室温孵育60 min。共焦显微镜(LEICA 公司)观察。每个标本取4 张切片，海马CA3 区摄片(×400)，Image Pro Plus 6.0 软件计算积分光密度。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理。计量资料服从正态分布，以()表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内进一步两两比较采用Bonferroni检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

丰富环境组较标准饲养组逃避潜伏期缩短(P＜0.05)。见表1。第6 天记忆能力测试发现，丰富环境组在目标象限中游动的距离和时间以及穿过原平台的次数也较标准饲养组多(P＜0.05)。见表2。

2.2 Western blotting和免疫荧光染色

丰富环境组Bcl-2、Bax 和Bcl-2/Bax 均较标准饲养组升高(P＜0.05)。见图1、图2，表3、表4。

3 讨论

脑卒中主要包括出血性和缺血性两种，缺血性脑卒中约占70%[15]。脑卒中存活者中约55.9%并发认知功能障碍，其中大部分为脑缺血患者[16]。本研究显示，丰富环境干预可明显改善脑卒中小鼠学习和记忆功能，可能与调控小鼠缺血后海马凋亡蛋白表达有关。

表1 各组Morris水迷宫逃避潜伏期比较(s)

表2 各组Morris水迷宫目标象限中游动距离和时间以及穿过原平台次数比较

表3 各组Western blotting蛋白表达比较(/β-tubulin)

表4 各组Bcl-2、Bax免疫荧光积分光密度

图1 各组Western blotting结果

以往研究发现[17-19]，丰富环境改善小鼠脑卒中后学习及记忆功能障碍的机制可能与促进海马齿状回神经发生有关。丰富环境可以改善脑缺血小鼠海马区突触可塑性[20-21]。丰富环境神经保护的潜在机制主要有神经发生[22]、突触再生[23-24]或血管再生[25]。

细胞凋亡是导致脑缺血后神经元死亡的主要原因之一[26]，Bcl-2和Bax是调节细胞凋亡的关键蛋白[27-29]。被动运动和缺血前主动运动均能通过上调Bcl-2 的表达和维持Bcl-2/Bax 的比率，抑制梗死周围区域细胞凋亡，减少神经元丢失[30-33]。丰富环境可通过抑制神经细胞凋亡，改善脑卒中后大鼠运动功能[34]。脑梗死同侧海马CA1区可发生迟发性神经元死亡，可能由于促凋亡信号通过从梗死区到远侧海马的星形胶质细胞间隙连接传播所致[35]。本研究显示，减少梗死侧海马区的神经元凋亡，可能是丰富环境改善脑卒中后认知功能障碍的潜在机制之一。

大多数脑卒中患者的功能康复是一个长期过程，住院康复训练只占其中小部分时间，大部分康复在社区或家庭完成；为患者提供丰富环境，将对认知功能恢复起重要作用。

丰富环境在脑卒中功能恢复中的作用机制非常复杂，调控凋亡蛋白的表达只是其中之一，且本研究只关注了两个凋亡相关蛋白。今后将对凋亡蛋白通路上其他蛋白的调控进行深入探索。

图2 各组海马CA3区Bcl-2和Bax表达(免疫荧光染色，×400)