电针对APP/PS1小鼠脑功能活动影响的功能性磁共振成像研究

李乐 ，黄盛，李珑，张嘉泳，金婷婷，张宇豪，张冰雪，杨敏光，梁胜祥，王志福，柳维林，陶静，陈立典

1.福建中医药大学康复医学院，福建福州市 350122；2.福建省康复技术重点实验室，福建福州市 350122；3.福建康复产业研究院技术创新平台，福建福州市 350122；4.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建福州市350122

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种发病隐匿、多发生在60岁以上人群的神经系统退行性疾病，临床上较为典型的症状是记忆功能下降等认知功能障碍[1]。AD的主要病理特点是皮质和海马中β-淀粉样蛋白(β-Amyloid，Aβ)斑块沉积和神经纤维缠结出现[2]。APP/PS1双转基因型被广泛应用于AD 基础研究领域。

研究显示[3]，AD中神经元活动失调先于神经元损伤，并可能促进易损脑区神经元退化。AD 患者静息状态下，海马、后扣带和侧顶叶皮质等脑区功能活动下降[4]；当患者确诊为AD 时，Aβ 沉积进一步蔓延至额叶、顶叶等脑区。提示海马等学习记忆相关脑区在AD 早期就发生功能异常，随着受侵脑区增多，病情不断加重[5]。

目前临床上缺少对AD 确切有效的治疗方法[6]。针刺在临床上广泛使用，对认知功能障碍有良好治疗效果[7]。电针在针刺特定穴位的基础上，导入微量电刺激，以改善局部血液循环，调整人体功能。电针能调节中枢神经系统突触可塑性，减轻氧化应激，减缓海马神经元凋亡，从而减缓认知功能障碍[8]。本团队前期研究发现[9]，电针APP/PSl 双转基因小鼠，可以改善其学习记忆相关脑区的葡萄糖代谢和海马区神经递质，从而减缓小鼠学习记忆能力退化趋势。本研究进一步运用小动物磁共振成像观察电针百会、神庭对APP/PS1小鼠脑功能活动的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

APP/PS1 双转基因雄鼠和野生型雌鼠，购自南京大学模式动物研究所，喂养于福建中医药大学实验动物中心SPF 级实验室，实验动物许可证号SYXK(闵)2014-001。培育后取后代雄性小鼠作为实验对象。小鼠饲养环境为22 ℃，湿度50%～70%，光照12 h 黑夜12 h交替，自由摄食、饮水。

所有操作符合动物保护与使用实验操作规范。

1.2 基因型鉴定和分组

小鼠出生21 d 后，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)进行基因鉴定，取APP 和PS1 基因均为阳性的小鼠16 只，饲养至4 月龄(体质量20～25 g)，随机数字表法分为模型组和电针组，各8 只；同窝APP和PS1基因均阴性的雄性小鼠8只作为对照组。

1.3 主要实验试剂和器材

异氟烷、小动物呼吸麻醉剂：深圳瑞沃德生命科技有限公司。小鼠组织基因组DNA 提取试剂盒：BIOSPIN 公司。APP、PS1上下游引物，GADPH 上下游引物，100 bp marker：上海生工生物有限公司。PCR mastermix：FERMENTAS 公司。7.0 T 小动物磁共 振 仪(MiniMR-60 MRI System 7.0 T)：BRUKER 公司。小鼠旷场测试箱：上海欣软信息科技有限公司。华佗牌G6805 型电针治疗仪和针灸针(直径0.25 mm、长25 mm)：苏州医疗用品厂有限公司。凝胶成像系统、电泳槽和转印槽：BIO-RAD公司。

1.4 干预方法

电针组固定，按《实验针灸学》确定小鼠百会、神庭位置[10]。针灸针直刺，接电针仪，正极接神庭、负极接百会，疏密波，频率1/20 Hz，电压2 V，每次30 min，隔日1 次，每周3 次，共16 周。模型组和对照组仅给予同样程度抓取，并固定30 min。

1.5 新物体识别实验

训练和测试前24 h，将小鼠放入旷场测试箱中适应环境。训练阶段将两个相同的待熟悉物体(A 和B)放在旷场测试箱的左后角和右后角，打开视频录制设备，将小鼠面对箱前壁放置在前壁中点，自由探索10 min，将小鼠放回原饲养笼中，1 h后进行测试。测试阶段将测试箱左后角的A物体取出，换成新物体C。放置小鼠步骤同上，自由探索5 min。计算新物体识别辨别指数(discrimination ratio，DR)。

TB：与物体B 接触的时间；TC：与物体C 接触的时间。

1.6 功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging，fMRI)

T2WI RARE 序列：TR/TE 4200/35 ms，视野20×20 mm，平均4，矩阵256×256，层数35，层厚0.5 mm。复制T2WI 参数中的扫描层数和图框，b0匀场，后应用血氧水平依赖功能磁共振成像(blood oxygen level dependent functional magnetic resonance imaging，BOLD-fMRI)。BOLD-fMRI 扫 描 参 数：TR/TE 2000/10279 ms，重复次数200，视野20×20 mm，平均4，矩阵64×64，层数30，层厚0.5 mm。

1.7 图像分析

将BOLD-fMRI 图像应用插值法校正到同一时间界值。根据小鼠在扫描过程中头动情况，筛查数据，剔除平移＞1.5 mm 或旋转＞1.5°的样本。本实验过程中没有小鼠因头动而剔除。将图像标准化到脑空间模板。采用线性回归法剔除与神经活动无关的混杂信号，0.01～0.08 Hz 低频滤波。计算特定体素与其最相邻26个体素的时间序列，利用肯德尔和谐系数计算一个团块(27 个体素)内时间序列的一致性，得到局部一致性(regional homogeneity，ReHo)图。采用2×2×2 mm高斯核对生成的ReHo图进行平滑。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 基因型鉴定

待测样本APP(350 bp)和PS1(608 bp)基因均强表达(图1)，对应小鼠为APP/PS1转基因阳性鼠。

2.2 新物体识别实验

干预前，各组DR 无显著性差异(P＞0.05)。干预后，与对照组相比，模型组DR 下降(P＜0.05)；与模型组相比，电针组DR升高(P＜0.05)。见表1。

表1 各组DR比较(%)

2.3 ReHo图

干预前，与对照组相比，模型组右侧基底前脑和左侧海马ReHo 降低(图2)。干预后，与对照组相比，模型组ReHo 在双侧海马区均下降(图3)；与模型组相比，电针组双侧海马区和运动皮质区ReHo 升高，前扣带回ReHo下降(图4)。

图1 APP/PS1基因鉴定结果(部分小鼠)

图2 干预前模型组与对照组间ReHo比较

图3 干预后模型组与对照组间ReHo比较

图4 干预后电针组与模型组间ReHo比较

3 讨论

临床研究发现[11]，电针百会60 d 后，AD 患者简易精神状态检查(Mini-Mental State Examination，MMSE)评分提高。本课题组前期Meta 分析显示[12]，针刺百会、神庭穴4 周后，认知障碍患者MMSE 评分、神经行为认知状况测试评分均有改善，事件相关电位P300 潜伏期缩短，P300 振幅增加。谷巍等[13]针刺AD 患者百会、神庭等穴4 个月，患者阿尔茨海默病评价量表-认知分量表评分、MMSE 评分、数字广度测试和日常生活活动能力量表评分的改善均优于药物治疗组，且安全性更高。基础研究也发现[14]，电针百会、神庭可延缓AD小鼠的认知功能障碍。

APP/PS1 小鼠的认知障碍最早在4 月龄出现轻微改变，表现为Y-迷宫测试交替次数减少[15]。水迷宫测试中，3 月龄APP/PS1 小鼠与相同月龄野生型小鼠表现无明显差异，5 月龄时潜伏期显著延长，9 月龄和12 月龄时呈持续性低水平空间记忆习得能力障碍[16]。另一研究发现[17]，APP/PS1 小鼠7 月龄时，Morris 水迷宫测试也出现记忆障碍。本研究选择在4 月龄时进行电针干预，以延缓APP/PS1 小鼠的学习记忆能力下降。

空间记忆的形成与海马内磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，pCREB)增加有关[18]。而pCREB 与 神经元损伤后BOLD 信号有关，表现出脑区活动水平下降和功能连接异常[19]。多模态神经功能影像学显示，内侧颞叶、基底神经节、海马、后侧扣带回等脑区在AD 进展中进行性功能降低，与认知功能评分显著相关[20]。

本研究显示，4月龄APP/PS1小鼠ReHo下降区域首先发生在基底前脑和右侧海马。基底前脑神经元退化导致脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)分泌异常[21]。基底前脑神经元还表达P75 神经营养因子受体，基底前脑功能活动异常对认知功能障碍具有一定作用[22]。

作为学习记忆的核心脑区，海马损伤会导致不同程度逆行性遗忘。啮齿类动物海马损伤后，表现出空间学习记忆能力障碍，且海马损伤程度与行为学损伤高度一致[23]。一项基于AD 患者的长期纵向观察显示[24]，CA1 神经元在轻度AD 患者中减少，严重痴呆时减少更多。本研究显示，8 月龄APP/PS1 小鼠学习记忆功能明显下降，海马ReHo 降低，压后皮质等脑区ReHo升高。压后皮质普遍认为与记忆的提取相关，在从事记忆相关任务如回忆过往经历时，压后皮质被显著激活[25]。基底前脑、海马可能在AD 病理进程中首先受累，而学习记忆相关脑区，如压后皮质，Re-Ho 补偿性升高；早期电针干预后，APP/PS1 小鼠学习记忆能力改善，海马ReHo升高。

综上所述，电针百会、神庭可延缓APP/PS1 小鼠学习记忆功能减退，可能与增强海马的功能活动有关。有待进一步研究明确。