时间:2024-07-28
潘钰,汪璇,刘萍,陈赞,王玉兰
经颅和经脊髓重复磁刺激对脊髓半横断大鼠运动功能的作用①
潘钰1,汪璇2,刘萍2,陈赞3a,王玉兰3b
目的 观察经颅和经脊髓重复磁刺激对脊髓半横断大鼠运动功能的影响。方法建立T10大鼠脊髓半横断模型,脊髓半横断大鼠于术后4 d分别给予经颅和经脊髓重复磁刺激治疗,刺激强度为最大输出强度的35%,刺激频率5 Hz,每序列5 s,间歇2 min,连续10个序列,每天1次,每周5 d,连续2周。各组大鼠治疗前和治疗后进行BBB评分和水平梯子实验评价运动功能;术后38 d取患侧下肢胫前肌行降钙素基因相关肽免疫组织化学染色。结果经颅磁刺激组大鼠手术17 d后各时间点BBB评分和水平梯子实验步态正确率高于术后3 d和脊髓损伤组(P<0.05);经脊髓磁刺激组大鼠手术10 d后各时间点BBB评分和步态正确率高于术后3 d和脊髓损伤组(P<0.05),术后10 d步态正确率高于经颅磁刺激组(P<0.05)。经颅和经脊髓磁刺激组大鼠胫前肌运动终板降钙素基因相关肽表达显著高于脊髓损伤组(P<0.001)。结论早期经颅和经脊髓磁刺激可促进脊髓半横断大鼠运动功能改善,并改变远端肌肉的可塑性,经脊髓磁刺激可加速脊髓半横断大鼠运动功能恢复。
经颅磁刺激;经脊髓磁刺激;脊髓半横断;运动功能;恢复;大鼠
[本文著录格式]潘钰,汪璇,刘萍,等.经颅和经脊髓重复磁刺激对脊髓半横断大鼠运动功能的作用[J].中国康复理论与实践,2013,19(4):324-328.
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后神经系统和肌肉的可塑性变化,是运动功能恢复的重要机制[1-3]。脊髓损伤后的可塑性可发生于皮层、皮层下、脊髓和肌肉等部位,调控神经系统的兴奋性变化是脊髓损伤后康复治疗的重要手段[4-5]。磁刺激治疗通过利用时变电流流入线圈,产生时变磁场,从而在组织内感应出电流。临床和动物研究证实,磁刺激可调节正常个体和神经损伤后的兴奋性[4,6],进而逐渐被临床认识,并应用到各种神经系统疾病后神经功能调节治疗中[7-8]。磁刺激治疗脊髓损伤的研究起步较晚,不同刺激部位、刺激疗程和刺激剂量可带来不同的治疗效果。本研究拟通过给予脊髓半横断大鼠经颅和脊髓重复磁刺激,分析磁刺激治疗的有效治疗部位,为磁刺激治疗的临床应用提供实验依据。
1.1 动物及分组
健康雄性清洁级SD大鼠42只,由首都医科大学宣武医院动物实验室提供,体重250~300 g。分为5组:①正常对照组(n=6);②假手术组(n=6);③脊髓损伤组(SCI组,n=10);④经颅磁刺激组(rTMS组,n=10);⑤经脊髓磁刺激组(SC-MS组,n=10)。
1.2 脊髓半横断模型
实验动物术前8 h禁食,4 h禁水。10%水合氯醛3.5 ml/100 g腹腔麻醉,T10处椎板切开后,在T10-11间用虹膜刀片横断右半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫,刺激无反应,关闭切口。假手术组仅椎板切开,不横断脊髓。
1.3 磁刺激
rTMS组大鼠和SC-MS组大鼠于造模后第4天开始磁刺激治疗。采用Magstim rapid2磁刺激仪(英国Magstim公司,最大输出强度2.2 T)和蝶形线圈(直径25 mm)。动物清醒状态下采取俯卧位,固定于木盒中,两组动物分别将碟形线圈置于头部和T6~7椎体处。刺激强度为最大输出强度的35%,刺激频率为5 Hz,每序列5 s,间歇2 min,连续10个序列,1次/ d,下午3点进行,每周5 d,连续2周。
1.4 行为学评价
行为学评价由2名未进行磁刺激的实验者完成。分别于手术后第3、10、17、24、31和38天进行BBB评分[9]和水平梯子实验[10]。BBB评分在直径95 cm的场地进行。水平梯子实验使用长度和高度均为1 m的水平梯子,梯子横梁间隔6 cm,记录3次大鼠爬过80 cm梯子的正确率,取3次平均值。行为学评价每天上午9:00进行。
1.5 病理标本制作
各组动物术后第38天取材。10%水合氯醛3.5 ml/ 100 g腹腔麻醉后,给予灌注固定后取胫前肌,快速脱水,低温石蜡包埋。切取冠状组织片,切片厚度为6µm,每组织片每隔200µm连续取5张,分别做免疫组化及阴性对照染色,每个组织块取5组。
1.6 免疫组织化学染色
石蜡切片自然干燥,后续过程在湿盒中进行。0.01 mmol/L PBS缓冲液冲洗5 min,共3次;0.3% H2O2孵育5 min;0.01 mmol/L缓冲液冲洗5 min,共3次;封闭血清孵育,室温30 min;倾去封闭血清,滴加兔抗降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)抗体(稀释度1∶200,50 μl/片)置于4℃冰箱孵育过夜,用0.01 mmol/L PBS替代一抗作为阴性对照;0.01 mmol/LPBS缓冲液冲洗5 min,共3次;生物素标记羊抗兔IgG孵育37℃30 min;0.01 mmol/ L PBS缓冲液冲洗5 min,共3次;HRP标记的链霉卵白素工作液孵育37℃30 min;0.01 mmol/L PBS缓冲液冲洗5 min,共3次;DAB暗环境下显色,显微镜下观察显色程度,时间不超过5 min;自来水洗,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。40倍物镜下每张切片取相互不重叠的5个视野,采用德国LEICA生物医学图像分析系统计数CGRP阳性染色标记物数量,取平均值。
1.7 统计学分析
2.1 行为学评价
SCI组、rTMS组和SC-MS组大鼠术后因失血、感染、腹胀等原因分别死亡2只、3只、4只。
2.1.1 BBB评分
正常对照组大鼠和假手术组大鼠下肢BBB评分均为21分。手术后3 d,SCI组、rTMS组和SC-MS组大鼠下肢BBB评分明显下降,组间比较无显著性差异(P>0.05)。SCI组大鼠术后17 d下肢运动功能开始有所恢复,术后31 d和38 d BBB评分与术后3 d及10 d BBB评分比较有显著性差异(P<0.05)。rTMS组大鼠手术17 d后各时间点BBB评分与刺激前及SCI组相应时间点比较有显著性差异(P<0.05);SC-MS组大鼠BBB评分手术10 d后各时间点与SCI组相应时间点比较有显著性差异(P<0.01)。见表1。
2.1.2 水平梯子实验
正常对照组、假手术组大鼠步态正确率为100%。SCI组、rTMS组和SC-MS组大鼠术前步态正确率为100%。SCI组大鼠术后24 d步态正确率提高,与术后3 d和10 d比较有显著性差异(P<0.01)。rTMS组大鼠术后17 d步态正确率提高,与术后3 d和10 d比较有显著性差异;rTMS组手术17 d后步态正确率与SCI组相应时间点比较提高(P<0.05)。SC-MS组大鼠步态正确率术后10 d即有所提高,与术后3 d比较有显著性差异(P<0.05);手术10 d后各时间点步态正确率与SCI组比较提高(P<0.05);术后10 d和38 d步态正确率与rTMS组比较也有所提高(P<0.05)。见表2。
表1 三组各时间点BBB评分
表2 三组各时间点水平梯子实验步态正确率(%)
2.2 胫前肌运动终板CGRP蛋白表达
正常对照组和假手术组胫前肌运动终板可见CGRP免疫组织化学染色阳性,着色清晰,分布较为均匀。SCI组大鼠胫前肌肌间隙增大,肌肉萎缩,CGRP阳性染色标记分布不均匀,部分欠清晰,阳性标记数量(21.00±3.21)与正常对照组(41.16±4.79)和假手术组(39.50±5.68)相比减少(F=27.808,P=0.000);rTMS组(35.14±3.33)和SC-MS组(38.50±2.43)运动终板CGRP阳性标记数量与SCI组比较显著增加(P= 0.000),rTMS组和SC-MS组比较无显著性差异(P>0.05)。见图1。
磁刺激器自1985年由Barker等改进后,临床主要应用于评价运动神经传导功能,并成为对脊髓损伤后手术、治疗、康复效果进行评价的重要手段[11-12]。在传统磁刺激器使用过程中,如果多次给予较大刺激强度和刺激频率的刺激,会导致磁刺激线圈过热,只得停止给予刺激。近几年随着科技的进步,磁刺激线圈不断改进,风冷线圈和水冷线圈的发明,使得反复多次给予磁刺激治疗能在临床得以实现。特别是磁刺激可以调节深部神经的兴奋性这一特性,使磁刺激在脊髓损伤康复中的临床应用和研究有了突破性进展[4-5]。研究发现重复磁刺激对脊髓损伤后运动、呼吸和膀胱直肠功能障碍、痉挛等都有不同程度的治疗作用。但是目前大多数的临床医生和康复医生尚不了解磁刺激这一治疗技术。关于磁刺激治疗改善脊髓损伤后运动功能的有效刺激部位、刺激频率、治疗时间窗等都缺乏统一认识,因而极大影响磁刺激在脊髓损伤康复中的临床应用。
图1 各组大鼠胫前肌运动终板CGRP蛋白表达(400×)
以往关于重复磁刺激治疗脊髓损伤后运动功能障碍的临床和基础研究多是给予经颅磁刺激治疗。Belci等临床研究应用rTMS治疗不完全性脊髓损伤患者,发现治疗后患者皮层抑制程度下降,手掌鱼际肌肌电图刺激阈值下降,ASIA运动和感觉评分增加,完成9孔木钉摆放时间缩短,随访3周上述指标仍有改善[4]。Mori等研究发现,高频经颅磁刺激(5 Hz)可通过增加皮质脊髓束兴奋性,降低H反射波幅,降低多发性硬化患者肌张力[13]。动物研究发现,rTMS对低位脊髓损伤大鼠的运动功能恢复好于高位脊髓损伤大鼠,并认为经颅磁刺激对低位脊髓损伤大鼠的治疗作用可能与激活中枢模式发生器有关[9]。研究者还提出高位脊髓损伤大鼠运动功能恢复不佳可能与磁刺激线圈大有关,并推测磁场可能对损伤脊髓造成不良作用,但未获得直接的实验证据。Ahemd等报道脊髓半横断大鼠伤后早期在脊髓损伤部位给予15 Hz磁刺激治疗及技巧训练,运动功能的恢复低于脊髓损伤组大鼠,但给予1 Hz磁刺激治疗和技巧训练的大鼠运动功能恢复明显提高,并提出脊髓损伤后超早期高频磁刺激可能加重损伤脊髓局部的继发反应,而1 Hz低频磁刺激和技能训练的联合治疗可能减轻继发反应,从而促进大鼠运动功能提高,但单纯应用1 Hz磁刺激治疗损伤脊髓不能获得满意的运动功能恢复[14]。我们前期研究发现脊髓半横断大鼠伤后4 d给予10 Hz经颅磁刺激治疗运动功能的恢复明显好于伤后17 d治疗组。这些研究结果提示,决定磁刺激治疗效果的关键因素是刺激频率、刺激部位及治疗时间窗的选择。
本研究采用5 Hz的经颅磁刺激和经脊髓磁刺激,在大鼠脊髓半横断后4 d开始治疗,经脊髓磁刺激线圈定位在损伤脊髓以上4个节段处。研究结果发现,5 Hz经颅磁刺激组大鼠术后17 d运动功能(BBB评分和水平梯子实验踏步正确率)比治疗前和SCI组大鼠明显提高。5 Hz经脊髓磁刺激组大鼠术后10 d BBB评分和水平梯子实验踏步正确率即有所提高,与治疗前、SCI组大鼠和经颅磁刺激组大鼠比较差异显著。这一研究结果似乎与Poirrier[9]和Ahmed[14]的研究结果不相一致。Ahemd认为,15 Hz高频磁刺激可能使损伤脊髓产生过度兴奋作用,加重脊髓损伤后的继发性毒性反应,并推测高频磁刺激可能在脊髓损伤慢性期或恢复期使用会有效。本研究将经脊髓磁刺激线圈放置于损伤脊髓以上4个节段,可避免直接刺激损伤脊髓,还可以刺激脊髓发出的神经根,从而促进大鼠运动功能恢复。另外本研究选择刺激频率为5 Hz,一方面考虑较大刺激频率(如≥15 Hz)在脊髓损伤早期会加重继发性毒性反应,另一方面考虑已有研究证实5 Hz磁刺激即可以通过调节神经兴奋性提高运动功能或降低肌张力[12-13]。
磁刺激对运动功能的作用机制尚不清楚。动物实验发现rTMS可以提高环磷酸腺苷水平和脑源性神经营养因子的表达[15-16]。张新等观察到rTMS使脊髓损伤大鼠脊髓生长相关蛋白-43和5-羟色胺水平上调,提出磁刺激可能促进轴突生长锥的可塑性变化[17]。除了磁刺激对神经可塑性的影响,动物研究还发现磁刺激可促进动物下肢肌肉萎缩的改善[18]。本研究观察了各组大鼠胫前肌运动终板CGRP的表达。CGRP是一种神经肽类物质,在脊髓神经元和运动终板中均有分布,在运动终板中与乙酰胆碱共同参与调节神经肌肉的活动。当肌肉出现萎缩或改善时,CGRP会随之发生变化,是反映运动终板退变程度较为敏感的指标[19]。我们在实验中发现经颅和经脊髓磁刺激组大鼠胫前肌运动终板CGRP表达增加,提示磁刺激可能通过神经兴奋性调节改变远端肌肉的可塑性,从而促进运动功能的恢复。
早期经颅和经脊髓磁刺激可促进脊髓半横断大鼠运动功能改善,并改变远端肌肉的可塑性,经脊髓磁刺激可加快脊髓半横断大鼠运动功能恢复速度。
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Effects of Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation and Magnetic Stimulation over Spinal Cord on Motor Function Recovery after Spinal Cord Hemisection in Rats
PAN Yu,WANG Xuan,LIU Ping,et al.Department of Rehabilitation,Beijing Rehabilitation Center,Beijing,100144,China
ObjectiveTo observe the effect of repetitive transcranial magnetic stimulation(rTMS)and functional magnetic stimulation over spinal cord(SC-MS)on motor function recovery after spinal cord hemisection in rats.MethodsT10spinal cord hemisection model was made.The stimulation(5×10 s bursts of 5 Hz at 35%maximal stimulator output,each burst separated by a 2 m interval)was delivered daily, 5 d per week for 2 weeks.The treatment began at 4 d after surgery for rTMS group and SC-MS group.Motor function recovery was assessed with Basso,Beattie&Bresnahan locomotor rating scale(BBB)and the Horizontal Ladder test.The tibialis anterior was surgically removed at 38 d after spinal cord injury for calcitonin gene-related peptide(CGRP)iummunohistochemical staining.ResultsThe scores of BBB and Horizontal Ladder test were significantly more at 17 d after spinal cord hemisection in rTMS group than before treatment and in spinal cord injury group(P<0.05).In SC-MS group,the scores of BBB and Horizontal Ladder Test were significantly more 10 d after SCI than before treatment and in SCI group(P<0.05).The score of Horizontal Ladder test of SC-MS group was more 10 d after SCI than that in the rTMS gourp(P<0.05).The expression of CGRP on motor endplates of the tibialis anterior in rTMS group and SC-MS group were more than those of SCI group(P<0.01).ConclusionrTMS and SC-MS in acute stage can improve the motor function recovery and muscle plasticity after spinal cord hemisection in rats.The magnetic stimulation can facilitate the recovery of motor function after spinal cord hemisection in rats.
repetitive transcranial magnetic stimulation;magnetic stimulation over spinal cord;spinal cord hemisection;motor function;recovery;rats
R651.2
A
1006-9771(2013)04-0324-05
2012-10-30)
1.北京市自然科学基金(No.7123216);2.首都医科大学基础临床合作课题(No.2007JL12)。
1.北京康复中心康复医学科,北京市100144;2.首都医科大学生理学系,北京市100069;3.首都医科大学宣武医院,a:神经外科,b:中心实验室,北京市100053。作者简介:潘钰(1973-),女,辽宁沈阳市人,医学博士,副主任医师,主要研究方向:脊髓损伤康复。
10.3969/j.issn.1006-9771.2013.04.003
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