转化生长因子β1/Smads通路在急性心肌梗死后心肌重塑中的作用及祛瘀生新法的干预研究①

张秀静，赵海滨，王帅，郭梦，许晓英，马迪

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)后的心肌重塑与心脏破裂、室壁瘤形成及心力衰竭等严重并发症密切相关，在AMI死亡及预后中起至关重要的作用[1]。AMI后心肌重塑机制复杂，后果严重，疗效不理想，相关研究亟待深入。张海啸等实验表明，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)/Smads信号通路的过度激活在诱发并加重AMI后心肌重塑病理过程中居关键地位[2]。但目前对其活化调控缺乏有效手段。祛瘀生新法以中医“祛瘀血、生新血”为理论基础，对AMI后心肌重塑疗效肯定。本课题组通过研究祛瘀生新法在大鼠AMI后心肌重塑中的干预作用及对TGF-β1/Smads通路和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)动员的影响，探讨祛瘀生新法对AMI后心肌重塑的效应机制，为祛瘀生新药治疗AMI后心肌重塑提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

成年清洁级雄性Wistar大鼠50只，体重(250±10)g，合格证编号：0240574，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

血塞通软胶囊：生产批号为Z20040016，由昆明圣火制药有限责任公司提供；总RNA试剂提取盒：由康为世纪提供；5×SYBR Green PCR Master Mix：AB Applied Biosystems公司；dNTP：Solarbio公司；OligodT、Rnasin、M-MLV：PROMEGA公司；引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，PE标记的骨髓基质干细胞抗原1抗体及干细胞生长因子受体(c-kit)均由北京博奥森生物科技有限公司提供；M×3000P荧光定量PCR仪：Agilent Technologies Stratagene。

1.2 方法

1.2.1 动物模型 用随机数字表法将50只大鼠分为正常组、假手术组、模型组、中药组、西药组，每组10只，分笼饲养。

模型组：参照文献[3-4]制备AMI大鼠模型。盐酸戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉。经口气管插管行小动物呼吸机辅助呼吸，有氧正压通气，潮气量5~6 ml，吸呼比1∶2，呼吸频率80/min。连接标准12导联，记录大鼠心电图。经左前胸廓旁第3、4肋间逐层开胸，暴露心脏，分离心包，在肺动脉圆锥和左心耳交界处用5-0号丝线结扎左冠状动脉前降支(LAD)近端制成AMI模型，以心电图出现坏死性Q波判断为可能AMI，若无病理性Q波，则再次结扎，以提高AMI模型成功率，然后逐层缝合心腔。术后常规抗感染治疗。

中药组：制备AMI大鼠模型，术后立即给血塞通软胶囊治疗，给药量按《药理实验方法学》所示剂量换算法计算[5]：200 g大鼠计量(g/kg)=人的剂量(1 g/kg∙d)×0.018。每天灌胃1次，共用7 d。

西药组：制备AMI大鼠模型，第6天腹腔注射基质细胞衍生因子-1受体阻断剂AMD3100，5 mg/kg，余同模型组大鼠。

假手术组：大鼠经历上述手术过程，丝线从冠状动脉下穿过但不结扎。

正常组：不做造模处理。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测各组心肌组织TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA表达

1.2.2.1 心肌组织总RNA的提取 心腔内注射10%氯化钾使心脏停跳于舒张期，迅速取下心脏，去除心房大血管及心脏外结缔组织，冲洗干净，分别置于液氮中保存。左室用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。在冰块上切取50~100 mg的心肌组织块，采用试剂盒提取组织的总RNA，操作按说明进行。

1.2.2.2 cDNA的合成 RNA样品取10 μg，M-MLV反转录酶1 μl，无RNase(Ribonuclease)水补足至总体积25 μl。反应条件：42 ℃ 1 h；95 ℃15 min，4 ℃10 min。得反转录(reverse transcription,RT)终溶液即为cDNA溶液。

1.2.2.3 实时定量PCR 每种组织均以TGF-β1mRNA和β-actin基因引物进行定量PCR反应，每管设3个复孔，在96孔PCR板中进行。TGF-β1引物序列：上游引物5'-GTG TGG AGC AAC ATG TGG AAC TCT-3'，下游引物5'-TTG GTT CAG CCA CTG CCG TAC CGC-3'，产物143 bp。Smad3上游引物5'-GTC AAC AAG TGG TGG CGT GTG-3'，下游引物5'-GCA GCA AAG GCT TCT GGG ATA-3'， 产物 150 bp。Smad7上游引物5'-GGA GTC CTT TCC TCT CTC-3'，下游引物5'-GGC TCAATG AGC ATG CTT-3'，产物 125 bp。内参β-actin：上游引物5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TAG-3'，下游引物5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'，产物150 bp。反应条件：95℃，10 s；95℃，30 s；55℃，30 s。共40个循环。每例样本反应结束后由计算机自动计算并读出定量结果Ct值。Ct值采用2-△△Ct法进行相对定量。

1.2.3 病理形态学检查 各组处死大鼠，取心肌组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片HE染色，在光镜下进行病理观察。

1.2.4 流式细胞仪检测 大鼠麻醉后，腹主动脉采血，肝素抗凝。Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，稀释至1×106/ml，分别加入荧光素藻红蛋白(PE)标记的骨髓基质干细胞抗原1(CD117)抗体，流式细胞仪检测。

1.2.5 免疫组化检测 采用SP法，DAB显色，在400倍显微镜下计数单位面积内c-kit阳性细胞数，每张切片随机取9个视野，取其均值作为测定值，具体步骤参照试剂盒说明书。

1.2.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析。所得数据均用(±s)表示，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 心肌组织病理学观察

正常组及假手术组整体均呈现正常心肌膜组织。模型组：心肌细胞数量较少且散在，结缔组织整片广布，炎性细胞聚集，成纤维细胞多，整体呈现AMI(重症)心肌膜组织。中药组：心肌细胞间有大量炎性细胞聚集，整体呈现心肌炎心肌膜组织。西药组：结缔组织整片占据切片较大区域，炎性细胞散在，浅粉红色胶原成分较多，红细胞聚集且多，整体呈现AMI(轻症)心肌膜组织。见图1。

2.2 流式细胞仪检测

模型组阳性细胞数明显高于假手术组(P<0.01)，中药组与西药组均明显高于模型组(P<0.01)，中药组与西药组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.3 免疫组化检测

模型组单位面积内c-kit标记阳性细胞数高于假手术组(P<0.05)，中药组与西药组均高于模型组(P<0.05)，中药组与西药组间无显著性差异(P>0.05)。见图2、表2。

表1 各组外周血PE标记CD117细胞数流式细胞仪检测结果

表2 各组免疫组化c-kit标记细胞检测结果

图2 各组c-kit免疫组化染色(光学显微镜，400×)

2.4 实时荧光定量PCR检测

模型组与假手术组相比，TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表达均明显增加(P<0.01)，Smad7 mRNA表达降低(P<0.05)。中药组和西药组较模型组TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表达降低(P<0.05)，而Smad7 mRNA表达增加(P<0.05)。中药组与西药组比较，均无显著性差异(P>0.05)，见表3。

表3 各组心肌组织TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA实时荧光定量结果

3 讨论

AMI后心肌重塑是指由于心肌严重缺血、坏死所导致的一系列心肌结构、功能和表型的变化，主要包括[6]：①病理性心肌细胞肥大伴胚胎性基因再表达；②心肌细胞的凋亡与坏死；③细胞外基质过度沉积或降解增加。其分子和细胞机制复杂，目前尚未完全阐明。多数研究认为信号传导途径参与的神经内分泌-细胞因子系统是引起心肌重塑的关键因素[7]。

近年来，大量研究表明，在心肌损伤修复过程中，血管紧张素Ⅱ(angiotninⅡ，AngⅡ)、β肾上腺素、内皮素等引起心肌纤维化、心肌重塑均可导致TGF-β1增加、TGF-β1/Smads信号通路过度激活，这成了诸多因素所致心肌重塑的共同通路[8]。因而，TGF-β1/Smads通路激活在AMI后的心肌重塑过程中起重要作用。最近研究表明[9-10]，BMSCs“归巢”在AMI后心肌重塑保护效应中疗效确切，因而也应是较佳的治疗靶点，然而正常情况下外周血中干细胞含量很低，达不到修复坏死心肌所需的浓度。因此，西医学治疗AMI后心肌重塑，主要使用粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony stimulating factor,G-CSF)、AMD3100、粒巨细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophag colony-stimulating factor,GM-CSF)等作为AMI后干细胞“归巢”的有效动员剂，相关研究表明治疗AMI后心肌受损的有效性确切[11-12]。本实验证实心肌梗死后，外周血及梗死心肌区BMSCs明显增多，ADM3100对干细胞循环有动员效应。

AMI属中医“胸痹、真心痛”的范畴，是血道闭塞、血脉不通、瘀血滞塞脉络所致，以“血气不至”、“血凝而不流”、“血瘀滞不行”等为主要病理机制，以胸闷胸痛、心悸气短等为主要症状。“祛瘀生新”亦称化旧生新、除旧生新，方而通过祛瘀、化旧或去腐等方法来祛除体内沉积的瘀血及其他陈旧性的病理产物，另一方面而强调应用生新方法来召它血、生新血、生新络、生新物，“祛瘀”与“生新”相辅相成，不可偏废[13]。

本实验通过祛瘀生新法对大鼠AMI后心肌重塑的作用及对TGF-β1/Smads通路的干预后，经流式细胞仪及免疫组化检测发现，中药组较模型组BMSCs均明显增多，说明祛瘀生新法对其有动员效应，也是“生新血”的具体体现；TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表达有所降低(P<0.05)。分子生物学检测发现中药组较模型组Smad7 mRNA表达增加(P<0.05)，心肌组织损伤也有所减轻，TGF-β1/Smads通路作为关键调控因子参与AMI后的心肌重塑过程，祛瘀生新中药对TGF-β1mRNA、Smad3 mRNA表达的负性调节作用，同时增加Smad7 mRNA的表达，从而有效改善AMI后的心肌重塑，这可能是祛瘀生新法能抑制心肌梗死后心肌重塑的重要机制之一。至于祛瘀生新法是否还有其他的活化调控机制，还有待进一步深入研究。

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