针康法对局灶性海马缺血大鼠学习记忆能力及突触素表达的影响

赵振峰，金翊思

脑卒中患者常出现学习记忆功能障碍，学习记忆障碍不仅影响患者的躯体功能恢复，也严重影响其生活质量。针康法是一种中西医结合的综合康复方法，广泛在脑卒中康复中应用，能够明显提高脑梗死患者日常生活能力，改善认知功能[1-2]，降低脑水肿，促进室管膜下区神经干细胞的增殖和分化[3]。中枢神经系统可塑性是脑缺血后神经功能恢复的重要生物学基础，突触的重建是其关键步骤。突触素P38是一种存在于突触小泡膜上的钙结合糖蛋白，参与囊泡的转运和排放，突触重建时其表达增多，是突触重建的重要标记物，与学习记忆功能关系密切[3]。为此，本实验通过观察局灶性海马缺血大鼠针康法干预后突触素P38的变化情况，探讨其对学习记忆能力影响作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 健康清洁级雄性SD大鼠50只，体重200～250 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(许可证号SCXK(京)2009-0001)。将大鼠随机分为假手术组、模型组、头穴丛刺组、康复组和针康组，每组10只。

1.2 试剂和仪器 虎红粉剂(国药集团化学试剂有限公司)；冷光源(哈尔滨工业大学)；Morris水迷宫(华北正华生物仪器设备有限公司)；Y-型迷宫(淮安市天剑工具厂)。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 参照采用光化学法诱导法[4]：大鼠用10%水合氯醛按35 mg/kg腹腔注射进行麻醉后，将大鼠采取俯卧位放置在脑立体定位仪上，沿头部正中切开大鼠头皮暴露出颅骨，找到前囟点，在前囟点后3.5 mm、中线向左旁开2.0 mm处，用牙科钻钻开一个直径约1 mm的骨窗，光纤管尾端至硬膜下3.3 mm。腹腔注射1.5%(生理盐水稀释)虎红70 mg/kg，注射时间2 min。5 min后照射局部海马组织5 min。术后缝合头皮，正常喂养。模型成功后24 h进行干预。

1.3.2 干预方法 假手术组：不造模，常规麻醉，沿头颅切开头皮，用牙科钻在前囟后3.5 mm、中线向左旁开2.0 mm处钻孔，然后缝合头皮。

模型组：造模后不进行任何处理，自然恢复。

头穴丛刺组：参照华兴邦等研制的《大鼠穴位针灸图谱》，于造模后采用于致顺头部腧穴七区划分法取顶区。针具选择0.25×15 mm，进针3～10 mm，留针6 h。

康复组：造模后进行Morris水迷宫训练，从平台所在象限外的另外3个象限随机选择入水点，将大鼠面向池壁放入池中，记录大鼠寻找并爬上平台的时间，即潜伏期。如果大鼠2 min之内找不到平台，则将其放在平台上停留30 s后再放回笼中，此时潜伏期记为120 s。训练时依次从3个不同的入水点入水，每次入水点相同，训练的顺序固定。此项主要训练大鼠的学习记忆功能和游泳能力。每天训练1次。

针康组：造模后进行头穴丛刺法针刺法，并在留针期间进行Morris水迷宫训练，每天1次。

1.3.3 学习记忆能力的评估 Y-型迷宫：为一个三等臂式迷宫，每臂顶端设一信号灯，相应臂的信号灯亮，此臂即为安全区，其余两臂为危险区。训练中始终有一臂为安全区，安全区按无规则的次序变换。如果大鼠在通电后从所在亮臂跑到另一亮臂记为正确，跑到暗臂则为错误。一天内连续分段训练大鼠，每10次为1段，两段间大鼠休息2 min。记录大鼠掌握迷宫结构(续10次测试中有9次正确即为掌握迷宫结构)所需的训练次数，训练次数越少表明大鼠学习能力越强。

1.3.4 标本采集及指标检测 治疗14 d后，待大鼠检测完行为学后灌注取材。按0.35 ml/100 g体重的剂量腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠深度麻醉后，打开胸腔充分暴露心脏，灌注针刺入心尖，经左心室插管至主动脉，固定插管并剪开右心耳，灌注生理盐水，直至右心耳流出澄清液体，再灌注4%多聚甲醛固定液200 ml。灌注完毕后，断头取脑，置于多聚甲醛中固定。24 h后常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为5µm，采用免疫组化染色。

每张切片于10×40放大倍数下随机选5个视野，统计每个视野内的突触素阳性细胞数，凡显色者均为阳性。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以(±s)表示，组间差异采用单因素方差分析，组间两两比较采用Newman-Keuls法进行Q检验，显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 学习记忆能力 Y-型迷宫实验结果显示，与假手术组比较，各组分辨学习能力下降(P＜0.05)。与模型组比较，头穴丛刺组、康复组、针康组学习能力明显恢复(P＜0.01)，且针康组优于头穴丛刺组和康复组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠不同时间点学习记忆能力比较

2.2 海马突触素的表达 局灶性海马缺血灶周围突触素阳性细胞明显增多，表现为神经元轴突、树突、细胞体中褐色深染。其中轴突表达最为明显。与假手术组比较，各组大鼠的突触素表达明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，康复组、针康组表达明显增加(P＜0.01)，且针康组明显优于头穴丛刺组和康复组(P＜0.01)。

表2 各组大鼠突触素检测结果

3 讨论

突触素是一种位于突触囊泡膜上钙结合蛋白，是突触小泡特异性外侧膜蛋白，几乎所有中枢和周围神经系统的突触前终末内均发现有突触素，在突触囊泡转运、排放及内容物释放过程中都发挥着重要作用。P38既是突触发生的标志[4-5]，又是突触传递效能水平的反映[6]。P38除了影响突触囊泡在前突触末端的分布，还参与调节其他突触生成时必需蛋白的生成，其机制可能是突触素通过与肌动蛋白丝的结合，稳定突触囊泡，从而阻止这些蛋白的降解，因此，突触素的可能作用是作为介导突触形成信号通路中的上游分子。

针康法促进局灶性海马缺血大鼠学习记忆能力的机制可能有多种。电针结合运动疗法可增加脑缺血中心区神经生长因子的表达[7]，促进海马齿状回巢蛋白阳性细胞增殖[8]。孔妍等研究认为，针康法能提高缺氧缺血性脑损伤幼鼠学习记忆能力，其分子机制可能与海马CA1区海马微管相关蛋白-2(MAP-2)阳性细胞表达增加有关[9]。赵振峰等将60例大鼠随机分为假手术组，模型组，头穴丛刺组，康复组，针康组，采用光化学法诱导法制作海马缺血模型，分别在3d、7 d、14 d进行Y-型迷宫测试，并观察血管基质细胞衍生因子(SDF-1)的蛋白及其mRNA表达水平，结果发现，针康法能上调局灶性缺血大鼠海马SDF-1 mRNA表达，认为这可能是其促进灶性海马缺血大鼠学习记忆能力提高的机制之一[10-11]。

本实验结果显示，局灶性海马缺血大鼠在针刺结合康复训练治疗后P38表达增强，与模型组、头穴丛刺组、康复组比较有显著性差异(P＜0.05)。提示针康法能够上调脑缺血后海马区P38表达，进而改善学习记忆功能。表明针康法能明显促进脑缺血大鼠神经功能和学习记忆能力的改善，可能与其促进海马神经元突触前囊泡的数量增加有关。

本实验中针康组对脑缺血大鼠的学习记忆能力的改善，明显优于单纯的头穴丛刺组或康复组。表明针灸这一传统康复疗法与现代康复相结合在短时间内，对于改善缺血大鼠神经功能和学习记忆能力优于其他疗法。其机制可能与其针刺运动训练促进局灶性海马缺血大鼠患侧海马区P38蛋白表达有关。有实验发现在阿尔茨海默病患者，突触素免疫反应性在额叶皮质和海马显著减少，并且与认知功能损害呈负相关[12]，且动物实验也报道突触素表达水平与空间记忆能力密切相关，突触素表达较高的动物在Morris水迷宫测试中的成绩更好[13]。

由于突触形成和再生是多种因素相互作用的结果，此过程受很多种蛋白、因子表达变化的影响。

[1]唐强.头穴丛刺与康复治疗的有机结合[J].中国康复理论与实践,2011,17(4):301-303.

[2]王艳,张立,李淑荣,等.头穴丛刺结合认知训练对脑梗死患者认知功能障碍的影响[J].中国康复理论与实践,2011,17(4)：316-318.

[3]唐强,白晶,王艳,等.头穴丛刺法调控大鼠脑梗死后内源性神经干细胞增殖迁移分化的实验研究[J].中国康复医学杂志,2009,24(8):676-679.

[4]Khuchua Z,Wozniak DK,Bardgett ME,et al.Deletion of the N-terminus of murine MAP2 by gene targeting disrupts hippocampal cal neuron architecture and alters contextual memory[J].Neuroscience,2003,119(1):101-111.

[5]潘惠娟,李玲,刘卫,等.光化学法诱导大鼠双侧海马梗死模型的建立[J].中华物理医学与康复杂志,2005,27(11):645-648.

[6]Navone F,Jalln R,Di GG.Protein P38:an integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cell[J].J Cell Biol,1986,103:2511-2527.

[7]彭力,彭锐,吕军,等.电针结合运动疗法对脑缺血大鼠神经功能恢复及神经生长因子的影响[J].中国康复,2007,22(6):370-372.

[8]陆敏,张苏明,常立,等.不同干预方法对脑缺血再灌注大鼠海马齿状回巢蛋白表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2007,29(5):292-295.

[9]孔妍,唐强,朱路文,等.缺氧缺血性脑损伤后针康法对幼鼠学习记忆能力及海马微管相关蛋白-2表达的影响[J].中国康复理论与实践,2011,17(4)：310-312.

[10]赵振峰,王芳,刘宏光,等.针康法对局灶性脑缺血大鼠学习记忆能力及海马基质细胞衍生因子-1α mRNA的影响[J].中国康复理论与实践,2011,17(4):307-309.

[11]唐强,王芳,赵振峰,等.康复训练对大鼠海马梗死后SDF-1α蛋白表达的影响[J].医药前沿,2011,1(8):12-13.

[12]Liu X,Erikson C,Brun A.Cortical synaptic changes and gliosis in normal aging,Alzheimer's disease and frontal lobe degeneration[J].Dementia,1996,7(3):128-134.

[13]曲巍,王孝文,王金平.穹窿海马伞切断鼠脑突触素动态变化及Morris水迷宫重复训练对其影响[J].解剖科学进展,2010,16(2):105-109.