缺血性脑卒中血清低分子量蛋白质的表达①

王屹，于艳，涂文军，陈蕾，陈惠

目前，急性缺血性脑卒中的诊断主要依赖于临床表现和神经影像学资料。实际上CT的作用有限。而MRI检查价格昂贵、耗费时间长，同时可能由于患者自身原因，如躁动不安、有心脏起搏器或其他金属植入物而无法进行检查，限制了MRI的广泛使用。因而寻找快速简便的实验室血液检查方法对于该疾病的早期诊断和早期干预具有十分重要的意义。有实验室报道血清生物标记物在诊断急性缺血性脑卒中的应用价值。这些标记物包括：髓磷脂碱基蛋白(MBP)、S100蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、心脏脂肪酸结合蛋白(H-FABP)等[1-2]。然而，到目前仍未找到临床实用性强的血清学检测标志[3]。

缺血性脑卒中的发生进展是一个非常复杂的过程，近年蛋白组学技术特别是质谱技术为其诊断开拓了新的领域，复杂的蛋白表达模式将提供更多的信息，提高血清标记物用于该疾病诊断的能力。基质辅助激光解析电离(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization,MALDI)质谱技术是过去30年蛋白质组研究领域最重大的进展，具有高灵敏性、高特异性、高通量和快速检测的特点，可大大减少检测的时间，利于早诊断、早治疗。该技术已广泛应用于损伤和疾病早期诊断研究[4-5]。本研究旨在应用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技术寻找急性缺血性脑卒中患者与正常人之间的血清差异多肽，为急性缺血性脑卒中的早期诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 病例组 2011年1月～2011年9月北京博爱医院神经内科急性缺血性脑卒中住院患者，选取缺血性脑卒中病例标本45份，排除12份，33例入选病例组。其中男性15例，女性18例；年龄45～85岁，平均(68.18±12.86)岁；病程小于2周，平均5.8 d。由神经科医生根据中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010(中华医学会神经病学分会)[6]做出诊断，并经CT或MRI证实。纳入标准：①急性缺血性脑卒中：发病2周内；②年龄＞40岁。排除标准：①出血性脑卒中；②颅脑创伤；③中枢或周围神经系统疾病；④主要器官衰竭；⑤严重感染；⑥恶性肿瘤；⑦肝肾疾病。

1.1.2 对照组 39例同期来本院体验的正常健康者作为对照组。其中男性18例，女性21例；年龄55～92岁，平均(62.92±5.88)岁。

纳入标准：①年龄＞40岁；②常规实验室检查指标无异常。排除标准：①脑卒中；②颅脑创伤；③中枢或周围神经系统疾病；④主要器官衰竭；⑤严重感染；⑥恶性肿瘤；⑦肝肾疾病。

两组在年龄、性别方面无显著性差异(P＞0.05)。

1.2 血清处理 病例组在出现脑卒中相关的神经系统症状后取样，对照组于安静状态取样。均抽取静脉血4 ml，分离血清，标记并于-80℃保存。

1.3 试剂和仪器 乙腈、乙醇、三氟乙酸(购自美国SIGMA公司，色谱纯)；α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CCA)基质，弱阳离子交换磁珠(MB-WCX)、MALDI-TOF-TOF质谱仪(autoflexTMspeedⅢ)、抛光384靶板和8位手动分离磁架，均购自布鲁克•道尔顿公司。

1.4 方法 两组均进行全血细胞计数，包括血红蛋白、血小板；血液生化检查，包括总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和空腹血糖。

病例组依据美国国立卫生院神经功能缺损评分(the National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)标准评价卒中的严重程度，依据改良整体生活功能量表(modified Rankin Scale,mRS)评价功能恢复。记录患者病例资料，包括既往高血压、糖尿病、高血脂病史，是否吸烟等。

1.4.1 WCX磁珠捕获血清蛋白质 向含有活化磁珠的样品管加5 μl血清，室温静置5 min，将样品管放入磁珠分离器。使磁珠贴壁1 min，弃去悬浮的液体，加入100 μl磁珠清洗缓冲液，在磁珠分离器移动样品管10次后静置，弃去悬浮的液体，加入5 μl磁珠洗脱缓冲液，获得样品洗脱液。取1 μl样品洗脱液点在抛光384靶板上，同时在附近孔内点加标准品1 μl，置于室温至干燥，点加0.4 mg/ml HCCA基质1 μl，室温放置至干燥无液体残留。将点好样的靶板移至MALDI-TOF-TOF质谱仪的离子源中，样本在51%激光能量下进行解析和离子化，通过标准品对仪器进行校准。

1.4.2 数据收集和分析 应用FlexControl软件，在正离子-线性模式下检测病例组和对照组样本，检测的分子量范围为1000～10000 Da，累加10个点的数据(1000 shots)，峰强度低于300的峰不累加，保存累加的图谱。

1.5 统计学处理 通过质谱分析获得的谱图，使用ClinProTools软件进行峰的统计，寻找具有统计学意义的差异峰。采用SPSS 12.0统计软件根据统计资料的类型进行独立样本t检验或χ2检验。

2 结果

病例组的高密度脂蛋白显著低于对照组(P＜0.001)，空腹血糖水平高于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 病例组和对照组血液细胞学和生化检测结果

两组共获得55个差异峰(P＜0.05)。分子量1000～2000 Da范围中共有7个差异峰，包括4个正向增高的峰，3个反向差异峰，其中质核比为1864的峰在病例组中水平降低明显。见图1。其中20份(60.6%)病例组血清未检测到该峰。质核比为1864的峰是一个两组的反向差异峰。病例组中13份血清存在低水平的该峰，20份没有检测到该峰。

以是否检测到该峰将病例组分为两组，比较在年龄、性别、高血压、糖尿病、高血脂、吸烟情况、血红蛋白、血小板、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖、损伤严重程度及临床转归情况等方面的差异，结果表明，两组间在脑卒中危险因素、卒中的严重程度、功能恢复等方面无显著性差异(P＞0.05)。见表2～表4。

表2 病例组年龄、性别等危险因素分布情况

表3 病例组血液细胞学和血液生化检测结果

表4 病例组临床特征

3 讨论

蛋白组学和相关技术的发展为有效筛选疾病标记物提供了强有力的工具。自2002年以来，血清多肽组学已成功应用于多种肿瘤的诊断研究，如乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌等[4]；对神经系统其他疾病的蛋白标记物的筛选和鉴定，在老年性痴呆、帕金森病、神经系统创伤[7-9]等疾病中已有报道。但较多采用液相色谱和双向电泳的方法。

血清多肽谱分析在神经系统疾病中的应用为人们利用质谱技术在神经系统疾病中寻找血清蛋白组/多肽模式诊断带来了希望。然而相关报道极少。2007年Inagaki等应用超高效液相色谱法联用电喷雾飞行时间质谱(Ultra Performance Liquid Chromatography-Electro Spray Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometry，UPLC-ESI-TOF-MS）技术分析大鼠的毛发，成功地从易卒中自发性高血压大鼠的毛发找到卒中的潜在生物标记物[10]。2008年Chizuru等在高血压导致的脑卒中小鼠模型中使用表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱(Surface-enhancedLaserDesorption/Ionization Time-Of-Fflight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)的方法得到3个差异多肽峰，并利用液相色谱的方法对其中一个蛋白进行鉴定，显示为结合珠蛋白，提示该蛋白与高血压导致的脑卒中有关[11]。然而，上述技术常常出现重复性低的问题，不同的研究者使用相同的方法可能得到不同的血清多肽谱。

血清蛋白质组中的低分子量区具有丰富的疾病诊断信息。在生物质谱技术中，MALDI-TOF-MS技术在检测低丰度蛋白时具有高灵敏性、高特异性、高通量和快速检测的特点，MALDI-TOF质谱仪5 min即可测试一个样本，一台仪器即可达到全年36000例的筛查通量，大大减少检测的时间，利于早诊断、早治疗。

本实验联合弱阳离子交换磁珠和MALDI-TOF质谱技术，对33份缺血性脑卒中血清和39份正常对照血清进行分析，结果显示，两组共获得55个差异峰(P＜0.05)，分子量 1000～2000 Da范围中共有 7个差异峰，有4个正向增高的峰，有3个反向差异峰，其中质核比为1864的峰在病例组中水平降低，甚至未检测到。是否检测到该峰与年龄、性别、血红蛋白、血小板、总胆固醇、甘油三酯，高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖、脑卒中的严重程度、临床转归情况等无关。因此，这个潜在的生物标记物可作为缺血性脑卒中早期诊断的一个反向生物标记物，其应用不局限于病例组的特定亚群，具有广阔的应用前景。

本结果是在相对较少样本量的基础上得出的，为寻找缺血性脑卒中早期诊断的血清生物标记物，并最终确定其临床实用价值，需要其一步加大样本量进行分析，对所获得差异多肽或蛋白进行纯化、鉴定。通过大量的实验进行验证，从而建立一个由单一或多个血清生物标记物组成的早期诊断模型。

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