长链非编码RNA ZEB1-AS1促进食管鳞癌侵袭转移

刘 芬，刘晓媛，高 翔，葛晓松

1.江南大学附属医院肿瘤研究所，江苏 无锡，214062；

2.江南大学附属医院药剂科，江苏 无锡，214062；

3.江南大学附属医院肿瘤内科，江苏 无锡，214062

中国最新癌症流行病学的数据显示［1］，食管癌发病率男性居第三位，女性居第五位；食管癌死亡率居癌症致死率第四位。尽管近年来ESCC治疗取得了极大进展，但ESCC患者预后仍然不理想，5年总生存率低于10%［2］。究其原因，主要是ESCC发现晚，手术治疗后仍然易发生转移［3］。而目前，我们对ESCC侵袭转移的具体机制仍不完全清楚。因此，阐明ESCC侵袭转移的分子机制，对改善治疗策略和预测临床预后具有重要的科学意义和应用价值。

近年来，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）成为肿瘤研究的热点之一。lncRNA一般不具备蛋白编码功能，长度大于200 bp，lncRNA通过在表观遗传学、转录调控及转录后调控等多层次调控目的基因的表达，在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中发挥重要作用［4-6］。文献报道，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）锌指E-盒结合同源异形盒1-反义链1（Zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1，ZEB1-AS1）在人ESCC中高表达，且与肿瘤分级、浸润深度、淋巴结转移和患者预后相关［7］。但是，lncRNA ZEB1-AS1在食管鳞癌侵袭转移中的作用及其机制鲜见报道。本研究从细胞与分子层面探讨了lncRNA ZEB1-AS1促进食管鳞癌侵袭转移的机制。

1 方 法

1.1 试剂

DMEM培养基、100×青霉素-链霉素混合液（双抗）购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Clark公司，LipofectamineTM2000、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购自东仁化学科技（上海）有限公司。ZEB1单克隆抗体购自美国Proteintech公司。GAPDH抗体、蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司。Lnc ZEB1-AS1的小干扰RNA（siZEB1-AS1）及其阴性对照（siRNA negative control，siNC）由苏州吉玛基因股份有限公司合成。特异性引物（ZEB1-AS1、ZEB1、β-actin）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 细胞及培养

人ESCC细胞KYSE-30/180/410/510、EC109这5株细胞株均由本实验室保存，Eca109、TE-1、TE-13、CaEs-17购自南京凯基生物科技发展有限公司。细胞培养于含10%胎牛血清、1×双抗的DMEM培养基中，静置于37 ℃、CO2体积分数为5%的增湿环境中培养。

1.3 细胞转染方法

收取对数生长期的Eca-109细胞，每孔5×105个细胞均匀加到6孔板中，或者5×103个细胞均匀加到96孔板中。细胞完全贴壁后，按照LipofectamineTM2000说明书，分别转染小干扰RNA（siZEB1-AS1）及其阴性对照（siNC），终浓度100 nmol/L，37 ℃温育6 h，弃转染液，加入正常完全DMEM培养基，继续培养备用。siZEB1-AS1［8］序列反义链为5’-AACUUCUAGCCUCUCUUUCAA-3’，顺义链为5’-GAAAGAGAGGCUAGAAGUUCC-3’；siNC序列反义链为5’-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3’，顺义链为5’-ACGUGACACGUU CGGAGAATT-3’。

1.4 CCK-8实验

收取对数生长期的Eca-109细胞，以5×103个细胞均匀加到96孔板中，进行siRNA的转染。分别在转染后1、2、3、4和5 d，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃继续温育3 h。在酶标仪（Biotech）波长450 nm处检测各孔的吸光度（D）值，以空白孔调零。每组设立5个复孔，取平均值，以各组D450nm值代表细胞活力情况。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

严格按照试剂说明书，采用TRIzol提取细胞总RNA，Nanodrop 2000测定RNA浓度，检测其含量及D260nm/D280nm比值。按照试剂盒说明书，取1 μg总RNA、以20 μL体系反转录为cDNA。RTFQ-PCR的反应条件为95 ℃，30 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s共40个循环。引物序列ZEB1-AS1上游为5’-CACACGGTGCTTGTCTCACT-3’（反义链），ZEB1-AS1下游为5’-TAGGATCCCA CGGTTCTACG-3’（顺义链）；ZEB1上游为5’-TTCAAACCCATAGTGGTTGCT-3’（反义链），ZEB1下游为5’-TGGGAGATACCAAACCAA CTG-3’（顺义链）；β-a c t in上游为5’-G G G CACGAAGGCTCATCATT-3’（反义链），下游为5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’（顺义链）。以β-actin的Ct值作为参照，以2-ΔΔCt计算mRNA倍数变化。

1.6 蛋白提取及蛋白质印迹法（Western blot）检测

将Eca-109细胞进行siRNA转染48 h后，进行细胞质蛋白的提取，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转将蛋白由胶转至PVDF膜，采用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃温育过夜，随后用PBST缓冲液漂洗，加入二抗（1∶1 000）室温温育2 h，PBST漂洗，ECL显影。

1.7 划痕实验

对Eca-109细胞进行siRNA转染24 h后，收集细胞，接种于6孔板内，使细胞贴壁后融合度达90%以上。用10 μL移液器吸嘴划线，PBS漂洗后，在显微镜下拍照记录各组细胞划痕宽度。更换0.5%血清的DMEM培养基，常规培养。分别于1、2和3 d后拍照，记录各组细胞划痕宽度，计算细胞的划痕闭合率。

1.8 Transwell实验

细胞迁移实验：将Eca-109细胞进行siRNA转染24 h后，更换无血清DMEM培养基，饥饿培养24 h。次日收集细胞，PBS漂洗3次，重悬于无血清DMEM培养基中。将200 μL、5×104个细胞加入小室中，小室放入24孔板内，小室外加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM培养基。48 h后，取出小室，预冷无水甲醇固定15 min，结晶紫染色1 h，清水漂洗。显微镜下观察拍照。

细胞侵袭实验：细胞处理同细胞迁移实验。小室内提前加入一层Matrigel基质胶，37 ℃凝固待用。收集饥饿处理后的细胞，PBS漂洗3次，重悬于无血清DMEM培养基中。将200 μL、5×104个细胞加入小室中。后续步骤同细胞迁移实验。

1.9 统计学处理

所有实验均需重复3次，数据采用表示。采用统计学软件包SPSS 17.0进行分析，两组间比较用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 9株ESCC细胞中lncRNA ZEB1-AS1的表达水平

采用RTFQ-PCR检测9株ESCC细胞中lncRNA ZEB1-AS1的表达水平。结果显示，lncRNA ZEB1-AS1在Eca-109细胞中表达水平最高（图1），选取该细胞株为研究对象，进行后续实验。

图1 RTFQ-PCR 方法检测9株ESCC细胞中lncRNA ZEB1-AS1的表达水平Fig.1 Expression levels of lncRNA ZEB1-AS1 in 9 ESCC cells were detected by RTFQ-PCR

2.2 lncRNA ZEB1-AS1不影响Eca-109细胞增殖

采用siRNA干扰Eca-109细胞中lnc ZEB1-AS1的表达，通过RTFQ-PCR方法检测细胞中lncRNA ZEB1-AS1的表达水平。结果显示，与对照组细胞相比，干扰组中lncRNA ZEB1-AS1的水平显著下降（57%，图2A）。我们进一步通过CCK-8实验检测lncRNA ZEB1-AS1表达水平的变化是否引起细胞增殖情况改变。CCK-8结果显示，抑制lncRNA ZEB1-AS1的表达并未明显影响Eca-109细胞增殖（图2B）。

2.3 lncRNA ZEB1-AS1促进Eca-109细胞迁移

我们进一步通过划痕实验和Transwell实验检测lncRNA ZEB1-AS1表达水平的变化是否引起细胞迁移、侵袭能力的改变。划痕实验结果显示，与对照组细胞（siNC、Eca-109空白组）相比，干扰组细胞（siZEB1-AS1）2 d和3 d细胞的划痕闭合率显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。同时，Transwell迁移实验也显示，迁移至小室膜外侧的干扰组细胞显著减少［Eca-109空白组为（180±40）个细胞/视野，siNC组为（160±33）个细胞/视野，siZEB1-AS1组为（90±23）个细胞/视野；P＜0.05，图4A］。这说明lncRNA ZEB1-AS1能促进Eca-109细胞迁移。

图2 lncRNA ZEB1-AS1不影响Eca-109细胞增殖Fig.2 lncRNA ZEB1-AS1 did not affect cell proliferation

图3 lncRNA ZEB1-AS1促进Eca-109细胞迁移Fig.3 LncRNA ZEB1-AS1 promoted migration of Eca-109 cells

2.4 lncRNA ZEB1-AS1促进Eca-109细胞侵袭

细胞侵袭实验结果显示，与对照组细胞（siNC）相比，干扰组（siZEB1-AS1）迁移至小室膜外侧的细胞显著减少［Eca-109空白组为（55±13）个细胞/视野，siNC组为（50±10）个细胞/视野，siZEB1-AS1组为（25±16）个细胞/视野；P＜0.05，图4B］。这说明lncRNA ZEB1-AS1促进Eca-109细胞侵袭。

图4 lncRNA ZEB1-AS1促进Eca-109细胞迁移和侵袭Fig.4 lncRNA ZEB1-AS1 promoted migration and invasion of Eca-109 cells

2.5 lncRNA ZEB1-AS1上调ZEB1的表达

为了研究lncRNA ZEB1-AS1是否调控ZEB1的表达，通过siRNA干扰Eca-109细胞中lncRNA ZEB1-AS1的表达后，通过RTFQ-PCR方法和Western blot方法检测了各组细胞中ZEB1的表达水平。与对照组细胞相比，干扰组（siZEB1-AS1）细胞中ZEB1的mRNA［（72±12）%，P＜0.05］和蛋白［（53±5）%，P＜0.05］水平均显著降低（图5）。

图5 ZEB1 mRNA和蛋白表达水平Fig.5 mRNA and protein expression levels of ZEB1

3 讨 论

人lncRNA ZEB1-AS1的基因位于10号染色体短臂，全长2 449 bp［8］。近年来，研究聚焦在lncRNA ZEB1-AS1的癌基因特性。汇总21项涉及1 801例癌症患者的原创性研究进行Meta分析［9］，发现癌症患者lncRNA ZEB1-AS1高表达与患者总生存期（overall survival，OS）、无进展生存期（progression-free survival，RFS）、高肿瘤分期（high tumor stage，HTS）以及淋巴结转移（lymph node metastasis，LNM）密切相关，说明lncRNA ZEB1-AS1有望成为预测肿瘤患者预后的生物标志物。Wang等［7］的研究结论与之一致，在ESCC中，lncRNA ZEB1-AS1的表达是ESCC预后的独立预测因子。然而，该项目仅从患者癌组织及癌旁组织中检测lncRNA ZEB1-AS1的表达水平，并与患者临床病理学特征及预后进行分析，并未对其分子机制进行深一步研究。在本研究中，我们进一步从细胞与分子生物学层次，对lncRNA ZEB1-AS1在ESCC中的作用进行探讨。我们首次发现，lncRNA ZEB1-AS1通过促进ZEB1的表达，促进ESCC细胞迁移、侵袭；然而，并未观察到lncRNA ZEB1-AS1对细胞增殖有明显的改变。

以往研究对lncRNA ZEB1-AS1发挥癌基因作用的分子机制有一定程度的了解。ZEB1 是一个上皮间质转化过程的明星转录因子，在肿瘤恶性行为中发挥重要作用，包括肿瘤细胞抗凋亡、耐药、侵袭、转移甚至干细胞特性；已有研究证明，lncRNA ZEB1-AS1通过上调ZEB1表达促进肝细胞肝癌［8］、骨肉瘤［10］、前列腺癌［11］、宫颈［12］等转移。lncRNA ZEB1-AS1通过抑制细胞周期相关蛋白cyclin D1和CDK2抑制细胞周期进程，同时上调MMP2、MMP9、N-catenin等促进细胞上皮-间质转化，进而促进神经胶质瘤转移［13］。lncRNA ZEB1-AS1通过抑制细胞周期抑制因子p15，促进结直肠癌细胞增殖［14］。另一方面，mRNA在肿瘤中发挥重要作用。lncRNA ZEB1-AS1可作为miR-200s［15］、miR-101［16］的分子海绵，减轻其对ZEB1的抑制作用，促进骨肉瘤和结直肠癌细胞增殖和迁移；还可以调节miR-577［17］、miR-1224-5p［18］、miR-200b［19］的表达，促进神经胶质瘤、黑色素瘤、膀胱癌恶性表型。本研究发现，lncRNA ZEB1-AS1上调ESCC细胞中ZEB1 mRNA和蛋白的表达，促进ESCC细胞侵袭、转移。但是，lncRNA ZEB1-AS1改变了ZEB1下游哪些分子的表达，是否引起了ZEB1外其他信号转导通路关键分子的改变，还有待更深入的探讨。

总之，我们在细胞与分子生物学水平阐明了lncRNA ZEB1-AS1可能通过促进ZEB1的表达促进ESCC侵袭及转移的机制，从而为食管鳞癌侵袭转移机制研究提供新的理论依据。