BRD4通过SHH信号通路诱导甲状腺癌细胞增殖、侵袭与迁移

冀凯伦，刘 琪，牟作峰，马晓东，李国楼

1.潍坊医学院临床学院，山东 潍坊 261053；

2.潍坊市中医院乳腺甲状腺外科，山东 潍坊 261041

甲状腺癌是目前最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，近40年来其发病率逐年增高，在美国以每年3%的比例增长［1］，其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)是最常见的类型，目前针对PTC的治疗，主要以甲状腺癌根治切除术联合131I放射治疗以及甲状腺素内分泌治疗为主［2］。虽然PTC患者预后较好，但是一部分患者在随后的治疗中会出现继发性摄碘率下降、131I抵抗等，因此研究PTC的发生、发展机制，寻找治疗的特异性靶标对PTC患者的疗效和预后起关键作用。近年来有研究发现，表观遗传修饰可作为一种新的治疗方法，例如针对溴样结构域蛋白4(double bromodomain–containing protein 4，BRD4)的研究发现，其作为溴结构域和超末端结构(bromodomain and extraterminal domain，BET)家族中的一员，在肝癌、白血病、乳腺癌、胰腺癌及恶性黑素瘤的发生、发展中发挥了关键性的作用［3-8］，但关于BRD4在甲状腺癌中的作用仍不清楚，因此本实验旨在探究BRD4在PTC细胞中的作用。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取潍坊市中医院乳腺甲状腺外科2015年10月—2016年10月行甲状腺癌根治术，术后病理确诊为PTC的患者标本80例，每例标本包括癌组织和癌旁组织(距肿瘤1～2 cm并经病理证实的非癌组织)。

1.2 主要试剂及细胞株

人PTC细胞株TPC-1购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，DMEM、胎牛血清购自美国Solarbio公司，MTT试剂盒由上海碧云天生物技术有限公司供应，培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(离心柱型)及动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)由天根生化科技(北京)有限公司提供，兔抗人BRD4、SHH、GLI1、钠碘转运体(sodium iodide symporter，NIS)单克隆抗体及鼠抗兔IgG二抗均购自美国Abcam公司，β-actin单克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司，BRD4、SHH、GLI1、NIS及GAPDH引物购自上海吉玛制药技术有限公司，cDNA逆转录采用北京康为世纪生物科技有限公司提供的PrimeScript逆转录试剂盒，实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及转染

人PTC细胞株TPC-1在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养，培养基为含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM培养基。所有的实验细胞均处于对数生长期。转染前24 h将状态良好的TPC-1细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔接种2×105个细胞，按LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行转染，转染6 h后检测转染效率。实验分为实验组(转染siBRD4)和对照组(转染sicontrol)。

1.3.2 RTFQ-PCR检测

人PTC组织RNA及每组细胞的总RNA分别通过动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)、培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(离心柱型)提取，提取步骤按说明书进行。依照北京康为世纪生物科技有限公司提供的反转录试剂盒说明进行反转录，反应条件：42 ℃温育15 min，85 ℃温育5 min。BRD4顺义链：5’-GCACAATCAAGTCTAAACTGG AG-3’，反义链5’-TCATGGTCAGGAGG GTTGTAC-3’；内参GAPDH顺义链：5’-GTCATC AATGGAAATCCCATCA-3’，反义链：5’-CCAGTGGACTCCACGACGTAC-3’；SHH顺义链：5’-GCGACCGCAGCAAGTACG-3’，反义链5’-AGTGGATATGTGCCTTGGACTC-3’；GLI1顺义链：5’-TAAAGCCTTCAGCAATGCCAG TG-3’，反义链：5’-CAGCCAGGGAG TTACATACATACG-3’；NIS顺义链：5’-GA CAAACCTCTGAGGACAGGG-3’，反义链5’-ATACTGGGGACGGTTGAAGC-3’。

1.3.3 蛋白［质］印迹法(Western blot)检测

应用细胞裂解液裂解细胞，15 000×g振荡离心15 min后提取细胞总蛋白。采用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，将等量蛋白(30 µg)加入缓冲液，煮沸变性。然后在10%SDS-PAGE上电泳分离，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗置于4 ℃冰箱温育过夜(BRD4 1∶500，β-actin 1∶1 000)。采用TBST洗膜30 min，二抗1∶1 000温育2 h，免疫印迹化学发光检测。

1.3.4 MTT法细胞活力检测

采用MTT法连续动态观察沉默BRD4前后PTC细胞株TPC-1细胞活性情况。调整细胞密度为5×104个/mL，以每孔100 µL的体积接种96孔板，分实验组与对照组。待细胞贴壁生长后，分别在0、24、48和72 h时间点，向每孔中加入10 µL MTT溶液，培养箱中温育4 h后测定各组的吸光度(D)值，绘制两组细胞的活性曲线，比较活性变化。

1.3.5 平板克隆实验

分别将转染有siBRD4或sicontrol的TPC-1细胞种植于35 mm培养皿上300个/孔，每3天换液，培养10 d后，克隆细胞用0.1%结晶紫溶液染色，照相后计数。

1.3.6 Transwell小室细胞迁移实验

取处于对数生长期的siBRD4细胞及sicontrol细胞制成单细胞悬液，24孔板中每孔加入含10%胎牛血清的完全培养基600 µL，Transwell小室中加入含细胞的无血清培养基共约200 µL，含细胞4×104个，培养24 h后，95%甲醇固定，0.1%结晶紫溶液染色，显微镜下取10个视野，观察计算平均数。

1.3.7 Transwell小室细胞侵袭实验

用无血清的培养基将Matrigel胶稀释(胶和培养基的比例为1∶8)，每孔50 µL平铺于Transwell小室的上室膜上，细胞培养箱中温育1 h，待Matrigel胶固定。后续步骤同Transwell小室细胞迁移实验步骤，观察计算穿膜细胞数。

1.4 统计学处理

所有试验独立进行3次，应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，数值的记录方法两组计量资料采用两独立样本t检验方法进行统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BRD4在人PTC组织中过表达

为了研究BRD4在PTC组织中的表达情况，本实验应用RTFQ-PCR测定80对人PTC组织及癌旁组织中BRD4的表达情况。结果显示，在PTC组织中，BRD4的表达明显高于癌旁组织(P＜0.05，图1)。

图 1 BRD4在PTC组织中过表达Fig. 1 Relative expression level of BRD4 mRNA is overexpressed in PTC tissue

2.2 沉默BRD4后PTC细胞株TPC-1细胞的生长增殖能力增加

首先应用siBRD4干扰基因转染PTC细胞株TPC-1，应用Western blot检验沉默效果(图2)。随后以MTT实验连续动态观察PTC细胞株TPC-1在转染siBRD4和sicontrol后，观察0、24、48和72 h时PTC细胞株的细胞活性情况。测定各组细胞的D值，绘制细胞的生长活性曲线。结果显示，PTC细胞株TPC-1在BRD4沉默后，细胞生长活性明显减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示沉默BRD4有抑制TPC-1细胞增殖的作用(图3)。

图 2 Western blot检测TPC-1细胞中BRD4沉默效率Fig. 2 The silence efficiency of BRD4 in TPC-1 cells was examined by Western blot

图 3 沉默BRD4使TPC-1细胞活性降低Fig. 3 BRD4 silencing markedly inhibited the viability of TPC-1 cells

2.3 沉默BRD4后PTC细胞株TPC-1克隆形成能力降低

通过平板克隆实验，结果显示，转染siBRD4的PTC细胞株TPC-1形成的克隆数明显低于转染sicontrol的细胞株，形成的克隆数之间差异有统计学意义(P＜0.05，图4)。

2.4 沉默BRD4后PTC细胞株TPC-1迁移与侵袭能力降低

Transwell小室实验结果显示，转染siBRD4的PTC细胞株TPC-1的迁移与侵袭能力明显低于转染sicontrol的细胞株，细胞的迁移数目之间差异有统计学意义(P＜0.05，图5、6)。

2.5 Western blot及RTFQ-PCR检测BRD4沉默后PTC细胞株TPC-1中NIS基因及蛋白与SHH信号通路相关基因与蛋白的表达变化

应用Western blot检测沉默BRD4的PTC细胞株TPC-1中NIS蛋白及SHH信号通路下游靶基因SHH、GLI1的蛋白表达变化，并应用RTFQPCR检测其mRNA表达变化。结果显示，在TPC-1中，沉默BRD4后NIS基因及蛋白表达增高，而SHH信号通路的下游靶基因SHH、GLI1的蛋白及mRNA表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05，图7、8)。

图 5 沉默BRD4使TPC-1细胞的迁移与侵袭能力降低Fig. 5 BRD4 silencing reduced the ability of migrating and invading of TPC-1

图 6 下室中穿膜细胞数Fig.6 Quantization of migrating and invading of TPC-1 cells in the lower chamber

图 7 BRD4沉默后，TPC-1细胞中GLI1、SHH蛋白表达降低但NIS蛋白表达增高Fig. 7 Expression levels of SHH and GLI1 protein were downregulated but the NIS protein was upregulated in BRD4-silencing TPC-1 cells

图 8 BRD4沉默后，TPC-1细胞GLI1、SHH mRNA表达降低，NIS mRNA表达增高Fig. 8 Expression levels of SHH and GLI1 mRNA were downregulated but the NIS mRNA was upregulated in BRD4-silencing TPC-1 cells

3 讨 论

甲状腺癌作为目前最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，在所有癌症中居第9位［9］。有研究表明，基因突变在恶性肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用，除了过去几十年在甲状腺癌中已被证实的经典的基因突变，例如BRAF V600E、RET、PAX8/PPARγ、p53及RAS等［10］，最近的研究着重于表观遗传修饰的作用，如组蛋白修饰因子在分化型甲状腺癌中的突变［11-13］，可作为一种新的癌症治疗手段。

已有研究提示，抑制BRD4表达可以有效抑制乳腺癌、鼻咽癌及子宫内膜癌等多种恶性肿瘤的发展［14-18］，但关于BRD4在甲状腺癌中的具体作用机制并不清楚。为了探索BRD4在甲状腺癌中的作用，本研究首先以PTC患者为研究对象，检测PTC组织中BRD4的表达，结果显示，BRD4在PTC组织中高表达，表明BRD4在PTC的发展过程中可能发挥了致癌的作用。为了进一步验证BRD4的作用机制，本研究应用siRNA沉默技术抑制PTC细胞株TPC-1中BRD4的表达，通过MTT、Transwell侵袭小室及平板克隆实验证实，沉默BRD4后PTC细胞株TPC-1的细胞活力、增殖、侵袭及迁移能力减弱，表明BRD4在调节PTC细胞生物学行为中发挥了重要的作用。此外，针对SHH信号通路的研究发现，其在肝癌、胰腺癌及甲状腺癌中被激活后，可促进肿瘤的增殖、转移与侵袭［4,7,19-22］。已有研究证实，在肝癌和胰腺癌中，BRD4可通过调控SHH信号通路相关基因促进肿瘤进展［4,7］，但关于在甲状腺癌中BRD4与SHH信号通路的关系暂无报道，因此，在此基础上，沉默BRD4后进一步检测SHH信号通路下游相关靶基因及蛋白的表达变化，结果显示，在PTC细胞株TPC-1中沉默BRD4后，SHH信号通路下游相关靶基因SHH、GLI1及其蛋白的表达明显降低，表明在PTC细胞中BRD4可能通过上调SHH信号通路相关基因促进其增殖、侵袭与转移。

此外，多项研究已经证实，NIS是一种分布在甲状腺滤泡细胞基底膜上的糖化膜蛋白，其在碘的摄取过程中发挥了重要作用，目前已被广泛用于诊断甲状腺癌及分化型甲状腺癌的放射性碘治疗［23-24］。Caillou等［25］的前期研究发现，131I在甲状腺癌组织中的摄取量与NIS的表达呈正相关。并且Min等［26］研究报道，NIS蛋白的表达水平可以预测分化型甲状腺癌131I的摄取能力及131I疗效评价。因此为了进一步研究在PTC细胞株TPC-1中，沉默BRD4后是否影响NIS的表达，本研究中应用Western blot及RTFQPCR检测在PTC细胞株TPC-1中，沉默BRD4前后NIS基因及蛋白的表达变化，结果表明，NIS mRNA及蛋白均表达增高。进而推测沉默BRD4可能会通过增加NIS的表达，增强PTC细胞的摄碘能力，从而提高131I治疗的疗效，但关于沉默BRD4后对PTC细胞摄碘能力的具体影响及其机制有待进一步研究。

综上所述，本研究证明了BRD4在PTC组织中异常表达，以及BRD4对PTC细胞生物学行为影响的机制，并且进一步证实了通过抑制BRD4的表达可增强NIS基因的表达，为下一步研究BRD4沉默联合131I对PTC患者的治疗提供了理论依据。

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