MicroRNA-21调控乳腺癌对吉西他滨耐药的机制

复旦大学附属肿瘤医院肿瘤内科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

MicroRNA-21调控乳腺癌对吉西他滨耐药的机制

吴振华，陶中华，张剑，解婕，胡夕春

复旦大学附属肿瘤医院肿瘤内科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

背景与目的：以吉西他滨为基础的联合用药在转移性乳腺癌中展示出很好的临床疗效和安全性，但耐药的出现导致治疗失败。MicroRNA是一类非编码小分子RNA，起到类似癌基因或抑癌基因的作用。虽然肿瘤中关于化疗药物耐药的机制报道很多，但microRNA异常表达与耐药之间的关系及机制还不十分清楚。本研究旨在探讨microRNA-21在乳腺癌吉西他滨耐药中的作用及其可能机制。方法：采用低浓度持续诱导MDA-MB-231细胞的方式构建人乳腺癌耐吉西他滨细胞株，药物敏感性差异达10倍以上，继而通过实时荧光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)、CCK-8、蛋白［质］印迹法(Western blot)、转染、划痕和Transwell等实验分别检测microRNA-21对药物的敏感性及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)标志物的影响。结果：在乳腺癌吉西他滨耐药细胞株中存在EMT现象，相比亲代细胞，microRNA-21呈高表达，并与吉西他滨敏感性呈负相关。转染microRNA-21的抑制剂和mimic可以分别下调和上调microRNA-21表达，同时EMT现象和药物敏感性也发生了相应的变化。结论：MicroRNA-21可能通过诱导肿瘤细胞的EMT发生而介导乳腺癌对吉西他滨的耐药。

MicroRNA-21；乳腺癌；吉西他滨耐药；上皮-间充质转化

吉西他滨是一种核苷类似物，对乳腺癌等实体肿瘤具有广谱的抗肿瘤活性。对早期治疗失败的局部复发或远处转移的晚期乳腺癌患者，吉西他滨常与其他化疗药物相联用，如与紫杉醇(GT方案)或顺铂(GP方案)联用作为晚期一线用药并显示出很好的临床疗效［1］。但经治疗后仍有一大部分患者出现耐药，导致治疗失败。在乳腺癌中吉西他滨耐药的机制报道尚不多见，具体机制有待进一步阐明。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指从具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力的一个过程，细胞形态发生改变并且变得更容易游走。其主要特征为细胞上皮标志物E-cadherin表达减少以及间充质标志物如Vimentin、N-cadherin表达增加［2］。最近越来越多的研究表明，EMT不仅在胚胎发育中发挥着重要作用，而且也与肿瘤的转移和耐药有关［3-4］，并且受到microRNA的调控［5-6］。

MicroRNA是长度在18～25个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，具有转录后基因调控功能［7］。近年来研究表明，肿瘤迁移、侵袭、黏附和EMT等多个肿瘤转移关键步骤中均有microRNA参与调控，起到类似癌基因或抑癌基因的作用。MicroRNA-21作为第一批在人类基因组中发现的microRNA，现已被证实在许多肿瘤(如胃癌、肠癌和乳腺癌等)中常过度激活［8］，起到类似癌基因的作用，并与肿瘤的侵袭和转移有关。近年来许多研究显示，microRNA-21的表达与药物的敏感性相关［9］，但在乳腺癌中尚未有microRNA-21与吉西他滨敏感性的报道。本研究发现，在乳腺癌中microRNA-21可能通过诱导肿瘤细胞的EMT发生而介导吉西他滨的耐药。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。胎牛血清FBS、L-15培养基、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)和0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；二甲亚砜(DMSO)、四甲基乙二胺(TEMED)和蛋白酶抑制剂购自美国Sigma公司，磷酸酶抑制剂购自罗氏公司，结晶紫染色液、RIPA 细胞裂解液和BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒购自美国东仁化学科技(上海)有限公司；Transwell小室和Matrigel胶购自于美国BD公司；吉西他滨(健择，GEMZAR)粉末购自法国礼来公司(200 mg，货号：C096711A)，PBS稀释配成不同浓度后于-20 ℃保存；microRNA-21 qRT-PCR正反向及逆转录引物、microRNA-21 mimic和抑制剂(inhibitor)均购自广州锐博生物科技有限公司。LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。一抗：E-cadherin(兔源单抗，货号：3195P)、Vimentin(兔源单抗，货号：5741P)和β-actin(鼠源单抗，货号：12262S)抗体购自美国Cell Signaling公司，Twist(兔源单抗，货号：ab152775)抗体购自英国Abcam公司；二抗：HRP-羊抗小鼠IgG和HRP-羊抗兔IgG购自上海威奥生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将人乳腺癌MDA-MB-231及其耐药细胞株置于含有10%胎牛血清的L-15培养基中，在37 ℃、CO2体积分数为5%的条件下培养，2～3 d传代1次。

1.2.2 细胞转染

实验所涉及的细胞以适当密度传代铺板，待融合至50%～70%时按照LipofectamineTM2000说明书转染microRNA-21 mimic及抑制剂，转染24～72 h后完成相关的Loss and Gain功能实验。

1.2.3 实时荧光定量PCR(real-time PCR，RTPCR)

利用TRIzol(Invitrogen)提取细胞中的总RNA，随后用PrimeScript RT Reagent试剂盒［购自宝生物工程(大连)有限公司］将RNA反转录成cDNA。按照产品说明书再用SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ对cDNA模板进行RT-PCR。

1.2.4 细胞形态学观察

选取细胞贴壁生长48 h时为记录时刻，在倒置显微镜下对细胞的形态进行拍照观察。

1.2.5 CCK-8法检测药物敏感性

在96孔板中每孔接种100 μL细胞悬液，细胞总数为5×103个。在37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中温育24 h，待细胞贴壁后加入10 μL不同浓度的吉西他滨，每一剂量组设5个平行孔。培养48 h后，吸净上清液后每孔加入110 μL用细胞培养基按10∶1 比例稀释的CCK-8溶液，37 ℃避光温育1～4 h后自动酶标仪测量562 nm波长下每孔的吸光度(D)值。上述实验重复3次，计算各组细胞在不同药物浓度下的细胞活力。

1.2.6 细胞划痕实验

细胞消化后以适当的密度接种到6孔板中，待密度融合至90%时，用白色枪头划“井”字线，分别在0和24 h时的倒置显微镜下拍照。

1.2.7 细胞侵袭实验

用50 mg/L Matrigel 1∶6稀释液包被Transwell小室基底膜上室面，每孔50 μL。置于37 ℃培养箱中4 h使胶聚合成凝备用。将MDA-MB-231及其耐药细胞胰酶消化后，107×g离心5 min后弃上清液，加入无血清细胞培养基进行重悬和细胞计数。两组细胞分别取2.5×104个/200 μL单细胞悬液加入Transwell上室，另在Transwell下室中加入600 μL含10% FBS的细胞培养基。在37 ℃细胞培养箱中培养24 h。去除小室中的培养基，用棉签轻轻擦去上层的细胞，置入预冷的4%多聚甲醛固定20 min。固定后用结晶紫进行染色25～30 min后，用PBS轻轻洗两遍，倒置晾干。在倒置显微镜下进行拍照计数，选取5(中心+4个象限)视野进行拍照计数，重复3遍，统计分析。

1.2.8 蛋白［质］印迹法(Western blot)检测

选取对数生长期的细胞，PBS洗涤2次，按细胞蛋白裂解液说明书操作提取细胞蛋白。BCA法测定各组细胞蛋白浓度，按每泳道20 μg蛋白上样，5%浓缩胶60 V，10%分离胶120 V，电泳分离约150 min。经100 V 120 min湿转至PVDF膜上。10%脱脂奶粉室温封闭90 min，分别加入一抗E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、Twist(1∶1 000)和内参β-actin(1∶4 000)，分别于4 ℃温育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min，HRP偶联的二抗(1∶2 000)室温温育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL发光液曝光显影。

1.3 统计学处理

采用Graph Pad Prism 5.0软件进行统计分析，双边t检验方法检验组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人乳腺癌MDA-MB-231耐吉西他滨细胞株的建立与鉴定

对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株进行低浓度的吉西他滨持续诱导，具体诱导程序为吉西他滨连续处理1周后，正常培养液处理1周，吉西他滨起始浓度为12 nmol/L，依次递增，最后稳定在60 μmol/L，整个建立的过程超过1年［10］。采用CCK-8法测定亲代细胞MDAMB-231和耐药细胞株对吉西他滨的敏感性，耐药细胞株对吉西他滨的敏感性明显低于亲代细胞(图1)。

图1 CCK-8检测MDA-MB-231亲代和耐药细胞对吉西他滨的敏感性Fig. 1 CCK-8 assay was used to detect chemosensitivity in parent and gemcitabine resistant MDA-MB-231 cell lines

2.2 人乳腺癌MDA-MB-231耐吉西他滨细胞株中存在EMT现象

在建立MDA-MB-231吉西他滨耐药细胞株的过程中，发现细胞的形态由亲代的短棒状变为耐药的长梭状，细胞的表型发生了改变。本研究进一步从细胞的迁移、侵袭能力以及EMT的指标来探讨耐药细胞中是否发生了EMT。划痕及Transwell实验结果表明，耐药细胞与亲代细胞相比，迁移和侵袭能力增强。同时Western blot检测结果揭示，在耐药细胞中，间充质表型标志物波形蛋白Vimentin和转录因子Twist过度表达，而上皮标志物E-cadherin表达降低。这些均表明耐药细胞株中发生了EMT(图2)。

2.3 MicroRNA-21与吉西他滨的敏感性呈负相关

通过RT-PCR检测发现microRNA-21在耐药细胞中过度表达，约为亲代的2.7倍(图3A)。Loss and Gain功能实验发现，在亲代细胞中通过LipofectamineTM2000瞬时转染microRNA-21 mimic，使microRNA-21过度表达，发现对吉西他滨的敏感性下降(图3B、C)。而在耐药细胞株中转染microRNA-21抑制剂后，发现对吉西他滨的敏感性增强(图3D、E)，表明microRNA在乳腺癌中与吉西他滨的敏感性呈负相关。

2.4 MicroRNA-21调控乳腺癌吉西他滨耐药中EMT现象

通过Loss and Gain功能实验，使亲代细胞中microRNA-21过表达而在耐药细胞中低表达。Western blot检测EMT相关指标的变化，结果显示，在亲代细胞中转染microRNA-21 mimic后，E-cadherin表达降低而波形蛋白Vimentin和转录因子Twist表达增加，诱导EMT发生。在耐药细胞中使microRNA-21表达下调后，E-cadherin表达上调、Vimentin下调、Twist表达下调，发生间充质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)现象(图4)。由此可以推断microRNA-21调控乳腺癌中吉西他滨耐药相关的EMT。

图2 耐药细胞中发生EMT现象Fig. 2 EMT was involved in gemcitabine resistant breast cancer cells

3 讨 论

乳腺癌已成为当今严重威胁女性身心健康的恶性肿瘤，在我国乳腺癌的发病率呈逐年递增的趋势。研究发现约90%的早期乳腺癌患者最终发展成晚期乳腺癌并发生多药耐药［3］。我们临床试验研究已证实吉西他滨与顺铂联用作为转移性三阴性乳腺癌晚期一线用药显示出很好的临床疗效和安全性［1］。但经治疗后仍有一大部分患者出现复发转移，导致治疗失败。因此，探讨乳腺癌中吉西他滨耐药的机制以及如何逆转耐药具有重要的理论意义和临床应用价值。

吉西他滨是一种核苷类似物，属于抗代谢类肿瘤药物，其本身并不具有抗肿瘤作用，而是通过代谢产物而产生细胞毒性作用。其转运途径及代谢过程中酶活性的异常均会引起其耐药［11］。目前已报道与吉西他滨耐药相关的机制主要有：核转运相关蛋白hENT1表达减少［12］，细胞膜上多重耐药相关蛋白5(MRP5，ABCC5)表达增加［13-14］，作用靶点RR酶活性增强［15］，脱氧胞苷激酶(dCK)活性降低［16］，PI3K-Akt促生成信号通路的过度激活及凋亡通路NF-κB的激活［14］。此外，肿瘤干细胞和EMT现象也参与吉西他滨耐药的过程。而在乳腺癌中，吉西他滨的耐药机制报道尚不多见，仅报道与RRM1［17］和NF-κB［18］信号通路的激活有关，其具体机制有待进一步阐明。

图3 MicroRNA-21表达与吉西他滨敏感性呈负相关Fig. 3 MicroRNA-21 was inversely correlated with gemcitabine sensitivity

图4 MicroRNA-21调控EMT标记物的表达Fig. 4 MicroRNA-21 mediated the expression of EMT associated markers

本研究通过低浓度持续诱导的方式构建了人乳腺癌MDA-MB-231耐吉西他滨体外模型，来进一步探讨乳腺癌中吉西他滨耐药的可能机制。在建立耐药细胞系过程中，发现细胞的表型发生了改变，由短棒状变为长条不规则状，同时转移和侵袭能力增强。Western blot检测结果也显示，耐药细胞中上皮标志物E-cadherin表达明显降低，间质表型标志物Vimentin表达增加，转录因子Twist被激活，证实在耐药细胞中发生了EMT现象。最近越来越多的研究表明，EMT与药物的耐药及肿瘤转移有关，如Xia等［19］发现在肝癌细胞中EMT与索拉菲尼耐药有关，Kitamura等［20］发现在肺癌中EMT与吉非替尼耐药有关。因此，我们推测在乳腺癌吉西他滨耐药细胞中EMT现象与吉西他滨的耐药有关。

MicroRNA-21是非编码小分子RNA，在许多肿瘤中常过度激活，起到癌基因的作用。有研究表明，在乳腺癌中microRNA-21可以作为区别浸润性癌和非浸润性癌的分子标志［21］，但是尚无与吉西他滨敏感性的报道。在本实验中发现，在耐药细胞中microRNA-21高表达，同时Loss and Gain功能实验证实，microRNA-21表达与吉西他滨的敏感性呈负相关。最近许多文献报道microRNA调控着EMT的表达，如microRNA-21 6/217调控在肝癌中的EMT现象［19］，由此我们假设，microRNA-21可能调控着乳腺癌吉西他滨耐药中的EMT。当在亲代细胞中转染microRNA-21 mimic后，E-Cadherin表达下降，Vimentin和Twist表达上调，发生EMT。而在耐药细胞中使microRNA-21表达下调之后，E-Cadherin表达上调，Vimentin和Twist表达下降，发生MET。由此可见，microRNA-21调节着耐药细胞中的EMT现象。

综上所述，EMT可能是乳腺癌中吉西他滨耐药的机制之一，而microRNA-21可能通过诱导肿瘤细胞的EMT发生而介导吉西他滨的耐药，提示microRNA-21可能是乳腺癌逆转耐药的潜在治疗靶点之一。

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The underlying mechanism of microRNA-21 in gemcitabine resistant breast cancer cells

WU Zhenhua, TAO Zhonghua, ZHANG Jian, XIE Jie, HU Xichun (Department of Medical Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

HU Xichun E-mail: xchu2009@hotmail.com

Background and purpose:Gemcitabine-based chemotherapy has been shown to have significant activity and favourable safety in metastatic breast cancer patients, but the effectiveness is limited due to drug resistance. MicroRNAs are a family of small non-coding RNA molecules, acting as oncogenes or tumor suppressors. Although various mechanisms of chemoresistance have been uncovered, the aberrant microRNA expression and its relationship with drug resistance of breast cancer are still unclear. This study explored the potential role and underlying mechanism of microRNA-21 in gemcitabine resistant breast cancer.Methods:MDA-MB-231 cells were continuously exposed to the increasing concentrations of gemcitabine to induce drug resistance to gemcitabine, which was 10 times more resistant. Then multiple methods were used including real-time PCR (RT-PCR), CCK-8, Western blot, transfection, wound healing and Transwell assay to observe the effect of microRNA-21 on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and chemosensitivity.Results:The expression of microRNA-21 was up-regulated in gemcitabine resistant breast cancer cell line and inversely correlated with gemcitabine sensitivity. Manipulation of microRNA-21 status could change microRNA-21 level, and could result in corresponding changes in EMT status and drug sensitivity.Conclusion:MicroRNA-21 induces gemcitabine resistance possibly via EMT process in breast cancer.

MicroRNA-21; Breast cancer; Gemcitabine resistance; Epithelial to mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.002

R737.9

A

1007-3639(2015)05-0326-07

2014-12-13

2015-02-09）

国家自然科学基金面上项目(81372846)。

胡夕春 E-mail:xchu2009@hotmail.com