紫花牡荆素对SKOV3卵巢癌干细胞样细胞FoxO3a磷酸化的影响

姜玲，曹晓正，李程，肖荞，杨剑锋

1. 湖南师范大学附属第一医院妇产科，湖南 长沙410000；

2. 湖南师范大学医学院病理学教研室，湖南 长沙410013

紫花牡荆素对SKOV3卵巢癌干细胞样细胞FoxO3a磷酸化的影响

姜玲1，曹晓正2，李程2，肖荞2，杨剑锋2

1. 湖南师范大学附属第一医院妇产科，湖南 长沙410000；

2. 湖南师范大学医学院病理学教研室，湖南 长沙410013

背景与目的：肿瘤干细胞的存在是卵巢癌高复发率和高死亡率的原因。本文研究紫花牡荆素(casticin，CAS)对SKOV3细胞系卵巢癌干细胞样细胞(ovarian cancer stem cell like cells，OCSLCs)自我更新能力的影响及其机制。方法：体外培养SKOV3细胞系细胞，干细胞培养基悬浮培养SKOV3得到和扩增卵巢癌球形成细胞，即OCSLCs。蛋白［质］印迹法(Western blot)分析FoxO3a磷酸化水平。FoxO3a特异性siRNA转染抑制FoxO3a蛋白表达，并测定肿瘤球形成率。结果：与亲本细胞相比，OCSLCs高表达磷酸化FoxO3a蛋白，具有更高的肿瘤球形成率［(3.1±0.3)% vs (34.8±6.8)%，P＜0.05］。CAS显著抑制OCSLCs肿瘤球形成能力，并降低FoxO3a磷酸化水平。FoxO3a特异性siRNA转染抑制FoxO3a蛋白表达，拮抗CAS抑制OCSLCs肿瘤球形成作用。结论：降低FoxO3a磷酸化水平参与CAS抑制SKOV3细胞系OCSLCs肿瘤球形成作用。

卵巢癌；肿瘤干细胞；FoxO3a；自我更新

卵巢癌是妇科肿瘤死亡的最主要原因。手术联合铂类和紫杉烷类药物的卵巢癌标准一线治疗，自1996年以来没有显著改变［1］。大多数卵巢癌患者对化疗敏感，但肿瘤常在5年内复发，卵巢癌患者在标准治疗后的5年生存率迄今为15%～30%［2］。目前，迫切需要寻求改善患者长期生存的治疗药物。近年的研究表明卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells，OCSCs)在卵巢癌发生、发展中起决定性作用，针对性抑制或清除OCSCs的药物发现研究可能是卵巢癌治疗的革命性进步［3］。有研究显示，卵巢癌SKOV3细胞系球形成细胞具有卵巢癌干细胞样细胞(ovarian cancer stem-like cells，OCSLCs)的自我更新特性［4］，中药蔓荆子的主要活性成分紫花牡荆素(casticin，CAS)通过活化FoxO3a抑制FoxM1诱导卵巢癌细胞凋亡［5］。因此，本文主要研究CAS是否和如何抑制源自SKOV3细胞系OCSLCs自我更新能力。

1 材料和方法

1.1 细胞与细胞培养

人卵巢癌细胞系SKOV3细胞购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。用添加10% vol/vol胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基维持与扩增细胞。在成球培养中，收集细胞，用添加有100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、20 ng/mL人重组表皮生长因子、10 ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子、不含维生素A的2% wt/vol B27以及1% wt/vol N2添加物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的无血清DMEM/F12培养基悬浮细胞。以1 000个细胞/孔的密度接种于超低黏附6孔板(Corning Inc.，Corning，NY，USA)。每周2次添加生长因子。在传代成球培养中，300×g离心收集肿瘤球细胞，并将细胞分散成单细胞悬液，然后，干细胞培养基超低黏附板悬浮培养，形成新肿瘤球。第2次传代SKOV3细胞系球形成细胞被用于后续试验。肿瘤球形成率以下列公式计算：肿瘤球总数/接种的活细胞总数×100%。

1.2 试剂与抗体

CAS购自成都普瑞法科技开发有限公司，相对分子质量为374.3，呈黄色结晶，纯度为98.0%；用二甲基亚砜溶解(DMSO)溶解，制备为10 mmol/L储存液，在使用前用DMEM培养基(购自美国Invitrogen公司)稀释至标示的浓度。抗FoxO3a、抗p-FoxO3a和抗β-actin抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)购自美国Millipore公司；LipofectamineTM2000购自湖南科泰生物技术有限公司。

1.3 FoxO3a特异性siRNA转染

非特异性对照小干扰RNA(UUCUCCG AACGUGUCACGUdTdT)和FoxO3a小干扰RNA(ACUCCGGGUCCAGCUCCAC)由上海复蒙基因生物科技有限公司合成。按照产商推荐的操作步骤使用LipofectamineTM2000进行小干扰RNA的转染。转染48 h后，收集细胞，并进行药物处理、Western blot分析和肿瘤球形成率测定。

1.4 蛋白［质］印迹法(Western blot)分析

［5］的方法完成Western blot分析。抗FoxO3a、抗p-FoxO3a和抗β-actin抗体被用作一抗。Bio-Rad含量测定系统测定蛋白浓度。总蛋白经SDS-PAGE分离，并转移到PVDF。使用ECL高级蛋白印迹分析系统(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ，USA)检测信号。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 SKOV3细胞系原代与传代成球培养肿瘤球形成率的比较

干细胞培养基超低黏附板悬浮培养卵巢癌SKOV3细胞系细胞6 d得到非黏附克隆性肿瘤球(图1A)。肿瘤球细胞分散成单细胞，以1 000个细胞/mL的密度传代悬浮培养得到第2代球形成细胞(图1B)；第2代肿瘤球细胞能形成第3代肿瘤球(图1C)。与原代SKOV3细胞系成球培养肿瘤球形成率［(3.1±0.3)%］相比，再次成球培养肿瘤球形成率［(14.6±3.5)%］增高，第3代球形成细胞的肿瘤球形成率最高［(34.8±6.8)%］，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，在后续研究中，使用SKOV3第3代球形成细胞作为OCSLCs。

2.2 SKOV3细胞系细胞与球形成细胞FoxO3a磷酸化水平的比较

（3）调料：熟悉各种调料的性质，根据各个菜的特点研究调料，使用调料的特征来提高质量，丰富口味，由于调料更新较快，要不断吸取新调料来促进菜品提高，研究调料有利于研究新菜品，丰富菜品口味。

Western blot分析结果显示，与卵巢癌SKOV3细胞系细胞相比，SKOV3第3代球形成细胞高表达磷酸化FoxO3a蛋白(图2)。

2.3 CAS对SKOV3细胞系球形成细胞肿瘤球形成率的影响

肿瘤球形成实验结果显示，CAS降低卵巢癌SKOV3细胞系球形成细胞的肿瘤球形成率，呈浓度依赖性(图3)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 CAS对SKOV3细胞系球形成细胞磷酸化FoxO3a蛋白表达的影响

Western blot分析结果显示，CAS明显抑制卵巢癌SKOV3细胞系球形成细胞磷酸化FoxO3a蛋白表达(图4)。

2.5 FoxO3a特异性siRNA转染对CAS降低SKOV3细胞系球形成细胞FoxO3a磷酸化水平和肿瘤球形成率的影响

Western blot分析结果显示，FoxO3a特异性siRNA有效抑制SKOV3细胞系球形成细胞FoxO3a蛋白表达(图5A)。肿瘤球形成实验结果发现，FoxO3a特异性siRNA显著减弱CAS抑制SKOV3细胞系球形成细胞肿瘤球形成作用(图5B)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 卵巢癌SKOV3细胞系球形成细胞Fig.1 The sphere -for mingcells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

图2 卵巢癌SKOV3细胞系球形成细胞高表达磷酸化FoxO3a蛋白Fig. 2 Expression of phosphorylated FoxO3a in sphere-forming cells and parental cells

图3 CAS以浓度依赖方式降低SKOV3细胞系球形成细胞肿瘤球形成率Fig. 3 Effects of CAS on the tumor sphere formation of Sphereforming cells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

3 讨 论

越来越多的证据支持肿瘤干细胞理论，该理论认为肿瘤是由一小群肿瘤干细胞引起和维持［6］。肿瘤干细胞的概念对肿瘤的预防和治疗具有极深远的临床意义［7］。大量研究发现一些饮食来源的化合物是靶向肿瘤干细胞的有前途的化学预防药物，如CAS［8］、莱菔硫烷［9］和金雀异黄素［10］等。有研究证实，SKOV3细胞系球形成细胞具有OCSLCs特性，包括自我更新能力和高致瘤性［4］。因此，基于CAS可能靶向抑制OCSLCs自我更新，本研究检测CAS是否和如何抑制卵巢癌SKOV3细胞系OCSLCs肿瘤球形成能力。

图4 CAS下调SKOV3细胞系球形成细胞磷酸化FoxO3a蛋白表达Fig. 4 CAS down-regulated expression of pFoxO3a in sphereforming cells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

图5 FoxO3a特异性siRNA转染对FoxO3a蛋白表达和CAS抑制SKOV3细胞系球形成细胞肿瘤球形成作用的影响Fig. 5 Effect of FoxO3a specific siRNA transfection on FoxO3a expression and CAS inhibited tumor spheres formation of sphereforming cells derived from ovarian cancer SKOV3 cells

总之，肿瘤球形成法结果证实，CAS能靶向OCSLCs。此外，本研究结果表明，CAS活化FoxO3a是其作用可能机制之一。这些研究结果支持使用CAS预防和治疗卵巢癌，并为临床评价CAS靶向治疗卵巢癌提供了支持性实验依据。

［参 考 文 献］

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［2］ LIAO J, QIAN F, TCHABO N, et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism ［J］. PLoS One, 2014, 9(1): e84941.

［3］ CHEN D, PAMU S, CUI Q, et al. Novel epigallocatechin gallate (EGCG) analogs activate AMP-activated protein kinase pathway and target cancer stem cells ［J］. Bioorg MedChem, 2012, 20(9): 3031-3037.

［4］ NING Y, LUO C, REN K, et al. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5,4'-di-n-octyl genistein ［J］. Mol Med Rep, 2014, 9(5): 1982-1988.

［5］ JIANG L, CAO X C, CAO J G, et al. Casticin induces ovarian cancer cell apoptosis by repressing FoxM1 through the activation of FOXO3a ［J］. Oncol Lett, 2013, 5(5): 1605-1610.

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［9］ RODOVA M, FU J, WATKINS D N, et al. Sonic hedgehog signaling inhibition provides opportunities for targeted therapy by sulforaphane in regulating pancreatic cancer stem cell selfrenewal ［J］. PLoS One, 2012, 7(9): e46083.

［10］ MONTALES M T, RAHAL O M, KANG J, et al. Repression of mammosphere formation of human breast cancer cells by soy isoflavone genistein and blueberry polyphenolic acids suggests diet-mediated targeting of cancer stem-like/progenitor cells［J］. Carcinogenesis, 2012, 33(3): 652-660.

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［12］ SUNAYAMA J, SATO A, MATSUDA K, et al. FoxO3a functions as a key integrator of cellular signals that control glioblastoma stem-like cell differentiation and tumorigenicity［J］. Stem Cells, 2011, 29(9): 1327-1337.

The effects of casticin on phosphorylation of FoxO3a in stem-like cells derived from ovarian cancer SKOV3 cell line

JIANG Ling1, CAO Xiaozheng2, LI Cheng2, XIAO Qiao2, YANG Jianfeng2(1.Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital of Human Normal University, Changsha Hunan 410000, China; 2. Department of Pathology, Medical College of Hunan Normal University, Changsha Hunan 410013, China)

YANG Jianfeng E-mail: yjfbl@sohu.com

Background and purpose:Ovarian cancer is associated with a high recurrence and mortality due to the existence of cancer stem cells. The purpose of this study was to investigate the effect of casticin (CAS) on the capability of self-renewal in ovarian cancer stem cell like cells (OCSLCs) derived from SKOV3 cell line.Methods:SKOV3 cell line cells were cultured in vitro, and OCSLCs were obtained and amplified through suspended culture with conditioned medium of the stem cells. The phosphorylation level of FoxO3a was analyzed using Western blot. The protein expression of FoxO3a was inhibited by FoxO3a specific siRNA transfection, and then the ratio of sphereformation was detected.Results:Compared with parental cells, OCSLCs over-expressed phosphorylated FoxO3a (pFoxO3a) and had elevated ratio of sphere-formation [(3.1±0.3)% vs (34.8±6.8)%, P<0.05]. CAS significantly inhibited the capability of sphere-formation in OCSLCs and down-regulated the expression level of pFoxO3a. And the transfection of FoxO3a specific siRNA suppressed the protein expression of FoxO3a and attenuated the inhibitory effect of CAS on the sphere-formation of OCSLCs.Conclusion:Reduced expression level of pFoxO3a is involved in the effect that CAS inhibits sphere-formation of OCSLCs derived from SKOV3 cell line.

Ovarian cancer; Cancer stem cell; FoxO3a; Self-renewal

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.05.007

R737.31

A

1007-3639(2015)05-0360-05

2014-06-16

2014-09-18）

湖南省教育厅科学研究一般项目(13C524)。

杨剑锋 E-mail:yjfbl@sohu.com.