Vav3对人胃癌细胞株BGC823血管生成基因的调节作用及意义

河北医科大学第四医院外三科，河北 石家庄 050011

Vav3对人胃癌细胞株BGC823血管生成基因的调节作用及意义

檀碧波 李勇 范立侨 赵群 王冬 刘羽

河北医科大学第四医院外三科，河北 石家庄 050011

背景与目的：研究发现Vav3基因在多种恶性肿瘤中表达异常，但Vav3与胃癌血管生成的关系尚不明确。本研究通过抑制内源性Vav3，观察其对胃癌细胞血管生成基因表达的影响，并探讨其机制和意义。方法：荧光定量RT-PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测人胃癌细胞株BGC823、胃上皮细胞株GES-1中Vav3的表达；合成针对Vav3的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)，并转染胃癌细胞株BGC823；MTT法检测转染前后胃癌细胞的活性；检测转染前后BGC823血管生成相关基因血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)、VEGF-C、VEGF-D、血管生成素-2(angiogenin-2，Ang-2)、血管生成抑制蛋白-1(vasohibin-1)表达的变化。结果：Vav3在胃癌BGC823细胞中的表达明显高于胃上皮细胞株GES-1(P＜0.01)；Vav3-siRNA转染BGC823细胞后，Vav3表达明显受到抑制(P均＜0.01)；MTT结果显示Vav3-siRNA转染后，BGC823活性明显降低(P＜0.05)；转染后BGC823中VEGF-C和Ang-2表达均较转染前降低(P均＜0.05)，而vasohibin-1表达则升高(P均＜0.05)。结论：Vav3对部分胃癌细胞血管生成相关基因有调控作用，并可能通过这种作用促进肿瘤血管生成。

胃癌；Vav3基因；血管生成；RNA干扰

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，进展快，预后差，其重要原因在于胃癌具有较强的促进新生血管生成的能力［1-2］。但胃癌新生血管生成过程复杂，具体机制还不十分明确。Vav3作为原癌基因Vav家族成员之一，在肿瘤的发展、转移等过程中扮演重要角色，且与肿瘤细胞的血管生成有关［3-4］。但Vav3调节胃癌血管生成的功能及具体机制还不明确。因此，本研究通过RNA干扰技术抑制人胃癌细胞株BGC823中Vav3表达，探讨其调节肿瘤细胞血管生成的分子机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株和主要试剂

人低分化胃腺癌细胞株BGC823由本实验室保种，正常胃上皮细胞株GES-1购自中国科学院上海细胞研究所。MTT购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养液、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；荧光定量RT-PCR试剂盒购自美国Promega公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；兔抗人Vav3、血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)、VEGF-C、VEGF-D、血管生成素-2(angiogenin-2，Ang-2)、血管生成抑制蛋白-1(vasohibin-1)及β-actin多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；相关PCR引物、小干扰RNA由上海生工生物工程公司合成。

1.2 细胞培养

细胞置于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液中培养，2～3 d传代1次。实验时将处于对数生长期的细胞经消化分散后计数，制成细胞悬浮液备用。

1.3 Vav3-siRNA合成及转染

Vav3特异性小干扰RNA(Vav3-siRNA)序列参考文献［5］设计，序列为：5’-CCCAGUUUCU C U G U U U G A A G A A C A U-3’，无关对照siRNA(non-specific control siRNA，NS-siRNA)序列为5’-CCCUUCUCUGUUUGUAAAGAGACA U-3’。采用脂质体介导法，使用LipofectamineTM2000，按照说明书将Vav3-siRNA或对照NS-siRNA转染BGC823细胞株。

1.4 MTT法检测细胞活性

BGC823细胞以5×104个/mL密度接种于96孔板，生长至60%～70%时转染Vav3-siRNA或对照siRNA。每组设6个复孔。各实验组于实验结束前4 h加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT。培养4 h，弃培养液，各孔加入150 μL DMSO，室温振荡15 min，用酶标仪于波长490 nm处测吸光度(A)值。以上实验重复3次。生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.5 荧光定量RT-PCR检测目的基因mRNA表达

采用TRIzol一步法提取总RNA，取2 μg反转录合成cDNA。取2 μL反转录产物进行PCR反应以检测靶分子的mRNA表达，GAPDH为内参。按试剂盒说明建立终体积为20 μL的PCR反应体系，2 μL反转录产物、10 μL SYBR Green Mix (Applied Biosystems，Foster City，CA)、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。PCR热循环参数为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环。应用Primer 5.0设计引物并经过Blast比对检测特异性后用于实验。各基因引物序列：Vav3(81 bp)引物：正义链5’-CAAATTCACCGAGATCCTGT-3’，反义链5’-TGCTGGAGTGCTGTACGAAA-3’；VEGF-A(81 bp)引物：正义链5’-GCCTTGCCT TGCTGCTCTAC-3’，反义链5’-GATGATTCT GCCCTCCTCCTT-3’；VEGF-C引物(191 bp)：正义链5’-ACGAGCTACCTCAGCAAGA-3’，反义链5’-TTGTTCGCTGCCTGACACT-3’；V E G F-D引物(1 5 2 b p)：正义链5’-TCTCGCTCAGCATCCCATC-3’，反义链5’-CACCTCCACGCACGTTTCT-3’；A n g-2引物(3 2 9 b p)：正义链5’-CAAGACGGAACAACGAAC-3’，反义链5’-CACCGCTAACCAACCAAA-3’；Va s o h i b i n-1引物(1 2 8 b p)：正义链5’-CTGCCAATCAAATGCCTGGA-3’，反义链5’-AGCACGATGTGGCGGAAGTA-3’；G A P D H引物(1 3 8 b p)：正义链5’-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3’，反义链5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。RT-PCR检测结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，RT-PCR检测结果采用2-ΔΔCt法进行计算。GAPDH作为内参照基因。

1.6 蛋白质印迹法(Western blot)检测各目的基因蛋白表达

提取样本总蛋白，进行蛋白定量后，各取60 μg蛋白样本上样，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜，TBST配制的5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用稀释后的目标分子一抗或内参照β-actin一抗4 ℃温育过夜，经TBST漂洗3次后加相应辣根过氧化酶标记的二抗室温温育1 h，化学发光法显色，对条带进行积分吸光度扫描。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 Vav3在人胃癌细胞株BGC823中的表达

qPCR和Western blot结果均显示人胃癌细胞株BGC823中Vav3表达明显高于胃上皮细胞株GSE-1(P＜0.05，图1)。

2.2 Vav3-siRNA转染胃癌BGC823细胞对Vav3表达的影响

Vav3-siRNA转染BGC823细胞后，细胞中Vav3表达受到明显抑制，本实验中Vav3-siRNA在80 nmol/L、作用24 h时对Vav3抑制率达到90%左右。qPCR及Western blot验证结果一致(P均＜0.01，图2)。

2.3 Vav3-siRNA对BGC823细胞活性的影响

MTT结果显示，Vav3-siRNA转染后，BGC823细胞的存活率明显下降，且存活率与浓度、时间呈依赖性(P＜0.05)；转染对照siRNA的对照组与阴性组相比，增殖抑制率差异无统计学意义(P＞0.05，图3)。

图1 Vav3在BGC823细胞及GES-1细胞中的表达情况Fig. 1 Expression of Vav3 in gastric cancer cell line and gastric epithelial cell line

图2 siRNA转染对BGC823细胞Vav3表达的影响Fig. 2 Expression of Vav3 in BGC823 after Vav3-siRNA was transfected

2.4 Vav3-siRNA对BGC823细胞血管生成相关基因表达的影响

选取80 nmol/L的Vav3-siRNA、controlsiRNA分别转染BGC823细胞24 h后检测血管生成相关基因VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、Ang-2和vasohibin-1的表达情况。结果显示，转染后BGC823中VEGF-C、Ang-2表达均较转染前降低(P均＜0.05)，而Vasohibin-1表达则升高(P均＜0.05)，VEGF-A、VEGF-D在转染前后表达变化不明显(P均＞0.05，图4)。

图3 Vav3-siRNA对BGC823细胞活性的影响Fig. 3 Effect of Vav3-siRNA to activity of BGC823 (MTT assay)

图4 Vav3-siRNA对BGC823细胞血管生成相关基因的影响Fig. 4 Effect of Vav3-siRNA to angiogenesis related genes in BGC823 cells

3 讨 论

新生血管形成是促进实体肿瘤侵袭进展的重要原因，采取措施抑制新生血管生成已成为肿瘤治疗的热点［6］。胃癌具有新生血管生成迅速的特点，这是胃癌进展快、预后差的主要原因之一［7-8］。故阐明胃癌血管生成机制有重要意义。虽然在此方面取得了许多成果，但具体机制仍不明确。报道显示Vav3基因在胃癌中表达上调，与胃癌多种恶性生物学行为有关［9］，故本研究对胃癌细胞中Vav3的表达进行了探讨，发现Vav3在胃癌细胞株表达较胃上皮细胞株高，说明Vav3可能参与了胃癌的发生及进展。siRNA抑制内源性Vav3在胃癌BGC823细胞的表达后，细胞的增殖能力明显下降，证实了Vav3对胃癌细胞活性有促进作用，可能作为今后治疗的靶基因，值得进一步深入研究。

Vav3基因能通过调节Rho家族的不同成员活性参与对多条信号通路的调节作用［10-11］，Vav3通过这种功能可影响肿瘤细胞血管生成［4］。故本研究进一步从分子水平对Vav3受抑制后血管生成相关基因VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、Ang-2和vasohibin-1的变化进行了检测。VEGF家族成员可以促进新生血管生成，与肿瘤进展关系密切［12-14］。Ang-2是血管生成素家族成员之一，可导致肿瘤新生血管形成［15］。而vasohibin-1则有抑制内皮细胞生长和迁移的作用，对肿瘤新生血管的生成有抑制作用［16］。本结果发现Vav3受抑制时促进细胞血管生成的VEGF-C、Ang-2的表达下调，而具有抑制肿瘤细胞血管生成作用的vasohibin-1基因表达则明显升高。研究表明，MAPK信号转导通路对VEGF家族成员有重要的调节作用［17］，而Vav3基因调控的下游主要信号转导通路之一，即为MAPK信号转导通路［18］，因此我们推测Vav3基因有可能通过调节MAPK信号转导通路的活性而影响了VEGF-C的表达。同时本研究结果也发现，抑制内源性Vav3基因表达后VEGF-A、VEGF-D变化并不明显，说明Vav3基因影响的仅是VEGF家族中的部分成员，具体的机制还有待深入研究。关于Vav3基因影响血管生成抑制基因vasohibin-1表达的机制目前尚未发现相关报道，我们推测Vav3基因可能也是通过对一些信号转导通路调节而产生了这一效果。以上结果说明Vav3通过调节胃癌细胞血管生成网络中部分成员表达而导致胃癌细胞血管生成能力的增强，但直接的分子间作用机制还有待深入。

总之，本研究发现，BGC 823细胞中Vav3表达上调，降低Vav3表达可调控部分血管生成相关基因表达。这些结果提示Vav3可能作为原癌基因在胃癌细胞血管生成过程中发挥了重要作用，有可能作为胃癌治疗的新靶向基因。但本研究仅从分子水平进行了体外实验，Vav3对胃癌血管生成的确切效果还有待进一步体内研究予以证实。

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Effect and signi fi cance of Vav3 to angiogenesis of gastric cancer cell line BGC823

TAN Bi-bo, LI Yong, FAN Li-qiao, ZHAO Qun, WANG Dong, LIU Yu
(The Third Department of Surgery, the Fourth Af fi liated Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050011, China)

LI Yong E-mail: li_yong_hbth@126.com

Background and purpose: It was reported that Vav3 gene was expressed aberrantly in many cancers. But the relationship between Vav3 and angiogenesis genes of gastric cancer is still not clear. The purpose of this research was to investigate the effect and significance of Vav3 to angiogenesis of human gastric cancer cell line BGC823. Methods: The expressions of Vav3 in human gastric cancer cell line BGC823, gastric epithelial cell line GES-1 were tested by fluorecence quantitative RT-PCR and Western blot. Then Vav3-siRNA was synthesized and transfected into BGC823. Activity of BGC823 was measured with fluorecence quantitative RT-PCR and MTT assay. The expressions of angiogenesis related genes VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, angiogenin-1 (Ang-2), vasohibin-1 were determined by qPCR and Western blot. Results: Expressions of Vav3 were detected higher in gastric cancer BGC823 cells than in GES-1 (P＜0.01). Expression of Vav3 was inhibited by Vav3-siRNA (P＜0.05). Activity of BGC823 was obviously inhibited after Vav3-siRNA transfected with MTT assay (P＜0.05). The expressions of VEGF-C, Ang-2 were lower in cells after transfected by Vav3-siRNA(both P＜0.05); expression of Vasohibin-1 increased after Vav3-siRNA transfected into BGC823 (P＜0.05). Conclusion: Vav3 gene can regulate some angiogenesis related genes, and Vav3 may promote angiogenesis of gastric cancer cells with this fuction.

Gastric cancer; Vav3 gene; Angiogenesis; RNA interference

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.12.004

R735.2

A

1007-3639(2014)12-0901-05

2014-06-24

2014-08-07）

国家自然科学基金资助项目(81072033、81372580)；河北省自然科学基金资助项目(C2010000619)；河北省普通高校强势特色学科资助项目(冀教高［2005］52)；河北省科技支撑项目(14277779D)；河北省卫生厅重大医学科研课题资助项目(zd2013040)。

李勇 E-mail:li_yong_hbth@126.com