肝细胞癌组织中FoxP3+调节性T细胞与上皮间质转化和患者预后的关系

徐军王健胡勇程兰兰余宏宇

1.中国人民解放军第105医院病理科,安徽 合肥 230031；

2.第二军医大学附属长征医院病理科, 上海 200003

肝细胞癌组织中FoxP3+调节性T细胞与上皮间质转化和患者预后的关系

徐军1王健1胡勇1程兰兰1余宏宇2

1.中国人民解放军第105医院病理科,安徽 合肥 230031；

2.第二军医大学附属长征医院病理科, 上海 200003

背景与目的：肿瘤微环境中的调节性T细胞(tumor-infiltrating regulatory T cells，Tregs)在肿瘤的发生、发展中起重要作用，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是恶性肿瘤获得转移和侵袭能力的重要生物学过程，但对肝癌浸润性Tregs与EMT之间的关系尚不清楚,本研究探讨原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组织浸润的Tregs与EMT的关系及其临床意义。方法：采用免疫组化和核酸原位杂交技术检测74例原发性HCC和20例癌旁组织中Tregs标志物FoxP3和EMT标志物(E-cadherin、Vimentin蛋白和Snail mRNA)的表达。结果：HCC组织中每高倍视野的FoxP3+Tregs数为9.7(3.8～20.2)个，癌旁组织为1.7(0.5～4.2)个(P＜0.Ol),有门静脉癌栓和镜下癌栓的HCC组织Tregs数高于无门静脉癌栓和镜下癌栓组(P＜0.05)，高Tregs组术后无瘤生存率、总体生存率均低于低Tregs组(P＜0.05，P＜0.01)。Spearman相关分析表明，E-cadherin阳性率分别与另两种EMT标志物呈负相关(Vimentin：r= -0.572，P＜0.01；Snail：r=-0.597，P＜0.01)。Tregs数量与E-cadherin呈负相关(r=-0.513，P＜0.05)，与Vimentin和Snail呈正相关(Vimentin：r=0.598，P＜0.01；Snail：r=0.423，P＜0.05)。结论：HCC组织中浸润的Tregs有利于肝癌的侵袭、转移，与EMT关系密切，并且对患者预后判断有一定的参考价值。

肝肿瘤；肝细胞癌；调节性T细胞；上皮-间质转化

肿瘤局部微环境中的免疫细胞在肿瘤的发生、发展中起重要作用［1］。调节性T细胞(tumor-infiltrating regulatory T cells，Tregs)在肝癌、乳腺癌等肿瘤组织中浸润增多［2-3］,但其作用机制尚不完全清楚。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞，是上皮来源的恶性肿瘤获得转移和侵袭能力的重要生物学过程［4］，近年来EMT与肿瘤微环境中的免疫细胞之间的相互作用一直是研究热点。有研究报道利用Snail cDNA转染大鼠黑色素瘤细胞后，除了可以诱导出EMT外还伴随着Tregs增多引起免疫耐受，促进肿瘤转移［5］，由此设想肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组织中Tregs增多可能与EMT有一定关联。本实验采用免疫组化和核酸原位杂交技术检测肝细胞癌中FoxP3+Tregs和EMT标志物(E-cadherin、Vimentin蛋白质和Snail mRNA)的表达，探讨HCC组织浸润的Tregs与EMT的关系及其临床意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料

该研究经中国人民解放军第105医院伦理委员会审核通过。74例原发性HCC选自2005—2012年中国人民解放军第105医院普外科手术切除并经病理证实的组织，男性66例，女性8例，年龄11～85岁，中位年龄46岁，术前均未行放疗和化疗；Edmondson组织学分级Ⅰ+Ⅱ级53例，Ⅲ+Ⅳ级21例，UICC分期Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ+Ⅳ期35例。癌旁组织(对照组)取自距离癌灶边缘5cm以外的非癌组织共20例。术后患者每3～6个月行常规腹部B超或彩色多普勒、胸片和甲胎蛋白检查复发转移情况，必要时行CT或MRI检查，若出现转移复发，则为无瘤生存终止时间，随访采用门诊复查和定期电话回访，随访截止日期为2013年11月31日。

1.2 免疫组化染色

鼠抗人FoxP3单克隆抗体购自台湾Abnova公司(克隆号2A11G9，Cat：MAB5583)，工作浓度1∶400，兔抗人E-cadherin、Vimentin单克隆抗体购自福州迈新公司(即用型)，免疫组化试剂盒Ultraview Universal DAB detection kit(D06808)为Roche公司产品。石蜡切片脱蜡至水，其余步骤均按在全自动免疫组化仪(BenchMark-GX，Roche公司)进行。EDTA抗原修复8 min，0.3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，二抗为HRP muitimer，DAB显色，苏木素复染，分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。

1.3 原位杂交

人Snail mRNA原位杂交检测试剂盒购自博士德生物工程有限公司，寡核苷酸探针序列：5’-AGAGTTTACCTTCCAGCAGCCC TACGACCAGGCCC-3’，5’-AAGGCCT T C A A C T G C A A A T A C T G C A A C A A G G A ATA-3’，5’-TACCAGTGCCAGGCGTGTGC TCGGACCTTCTCCCG-3’。石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2室温作用10 min，胃蛋白酶室温消化30 min，冲洗后每张切片滴加20 μL预杂交液，湿盒放入40 ℃恒温箱中4 h。滴加20 μL杂交液/片，38～42 ℃恒温箱中过夜。用37 ℃预温的2×SSC、0.5×SSC、0.2×SSC液先后冲洗，滴加封闭液37 ℃ 30 min，加生物素化地高辛37 ℃60 min，再加生物素化地高辛和SABC，37 ℃20 min，滴加生物素化过氧化物酶37 ℃20 min，DAB显色，苏木素复染，分别设阳性对照、阴性对照。

1.4 结果判断

以FoxP3核阳性的淋巴细胞数量作为组织中Tregs数量，随机取5个高倍视野(×400)分别计数HCC组织和癌旁肝组织中Tregs绝对数，取平均数为每个样本的FoxP3+Tregs数量。E-cadherin、Vimentin以细胞质或膜出现棕黄色颗粒为阳性，Snail mRNA以细胞核或质出现棕黄色颗粒为阳性。计数方法为随机观察10个×400高倍镜视野，取平均值为阳性细胞百分数，0为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，51%～80%为3分，＞80%为4分；阳性强度分为弱(1分)、中等(2分)、强(3分)，两者相乘得出总分值(0～12)。

1.5 统计学处理

所有数据均用SPSS 19.0软件处理，HCC和癌旁的Tregs数量以中位数和四分位数间距即M(QR)表示，2组间比较采用Mann-whitney U检验，HCC组织中Tregs数量与临床病理参数之间的关系采用χ2检验，Tregs数量与E-cadherin、Vimentin和Snail之间的关系采用Spearman等级资料相关分析，采用Kaplan-Meier方法和Logrank检验进行生存分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HCC及癌旁组织FoxP3的表达情况

FoxP3阳性细胞主要位于HCC组织和癌间质中，为细胞核着色。HCC组织中每高倍视野(×400)的FoxP3+Tregs平均个数为9.7(3.8～20.2)个，癌旁组织为1.7(0.5～4.2)个，差异有统计学意义(P＜0.01，图1)。

图1 FoxP3在HCC和癌旁肝组织中的表达Fig. 1 Expression of FoxP3 in HCC and peritumoral tissues

2.2 HCC组织中Tregs数量与临床病理参数之间的关系

按Tregs中位数将样本分成高Tregs组和低Tregs组，高表达36例，低表达38例，有门静脉癌栓和镜下癌栓的HCC组织FoxP3+Tregs数高于无门静脉癌栓和镜下癌栓组(P＜0.05，表1)。

表1 HCC中Tregs的数量与患者临床病理参数的关系Tab. 1 Relationship of FoxP3+Tregs and clinicopathologic characters of 74 HCCs

2.3 Tregs数量与HCC预后的关系

74例HCC患者，22例失访，到随访截止期未复发未死亡6例、已复发未死亡5例，记为截尾值。结果显示高Tregs组术后无瘤生存率、总体生存率均低于低Tregs组(P＜0.05，P＜0.01，图2)。

图2 高Treg组和低Treg组术后无瘤生存率、总体生存率的比较Fig. 2 Correlation between Tregs and the rates of recurrence-free and overall survival

2.4 Tregs数量与EMT的相关性

E-cadherin表达于部分癌细胞和正常肝细胞，细胞膜阳性，Vimentin细胞质阳性，Snail mRNA定位于细胞质或细胞核。Spearman相关分析表明，E-cadherin阳性率分别与另两种EMT标志物呈负相关(Vimentin：r=-0.572，P＜0.01；Snail：r=-0.597，P＜0.01)。Tregs数量与E-cadherin呈负相关(r=-0.513，P＜0.05)，与Vimentin和Snail呈正相关(Vimentin：r=0.598，P＜0.01；Snail：r=0.423，P＜0.05，图3)。图3A、B、C、D均为同一例HCC组织，Tregs数量高(29个/HPF)，Vimentin和Snail表达显著增加，而E-cadherin显著下降。

图3 EMT相关标志物在HCC组织中的表达Fig. 3 Expression of EMT-related markers (E-cadherin, vimentin and Snail) in HCC

3 讨 论

Tregs在稳定自身免疫环境中发挥重要作用，但在抗肿瘤免疫应答中，Tregs则主要发挥抑制效应，通过抑制CD4+和CD8+T淋巴细胞白介素2基因的转录和表达来抑制T淋巴细胞的活化增殖，从而营造免疫抑制微环境［6］。Foxp3是CD4+CD25+Tregs的一个特征性标志，是免疫抑制的关键调节分子［7］。目前认为肿瘤局部微环境中的免疫细胞在肿瘤的发生、发展中起重要作用［1］。有研究显示，HCC实验小鼠模型的脾组织内Tregs数目较正常小鼠显著增加［8］，肿瘤患者外周血及肿瘤微环境中Tregs数量较正常人明显增多，并且多种肿瘤包括乳腺癌、结肠癌等组织中Tregs数量较癌旁组织增多［7,9］。本研究显示，HCC组织中FoxP3+Tregs数明显高于癌旁组织，与上述研究结果基本相符，提示Tregs可以促进HCC的发生。本实验结果还显示，有门静脉癌栓和镜下癌栓的HCC组织FoxP3+Tregs数高于无门静脉癌栓和镜下癌栓组，提示Tregs在HCC的进展和转移中发挥作用。可能因Tregss具有免疫抑制作用，与相应癌旁组织相比，癌组织Tregs浸润明显增多，使HCC微环境处于免疫抑制状态，从而使肝癌细胞逃脱自身免疫监视，促使肝癌的发生、发展和转移。

本研究结果显示，高Tregs组术后无瘤生存率、总体生存率均低于低Tregs组，癌组织Tregs浸润越多，患者生存时间越短，提示肿瘤浸润的Tregs数量增多不仅预示肿瘤播散、转移的危险，还能够预示患者的预后，与徐原林等［11］在弥漫大B细胞淋巴瘤、Bates等［12］在乳腺癌、Huang等［1］在肝癌、Salama等［13］在结直肠癌中的研究结论一致。通过检测术后HCC标本Tregs的数量可能对肿瘤的转移、预后做出判断和预测。如果能去除或减少HCC患者体内的Tregs或调节其对各种免疫活性细胞的免疫抑制功能，有可能提高HCC的免疫治疗效果，从而提高HCC患者的无瘤生存率和总体生存率。但该结果是建立在组织病理学上，必须提供肝穿或手术切除标本用于检测，下一步需检测外周血Tregs水平并研究其与患者预后的关系，以便全面探讨Tregs的预后价值。

EMT在癌症浸润转移过程中发挥着重要作用。有研究显示，在肿瘤侵袭前沿的细胞发生EMT后可获得移动、抗凋亡能力以及保持干细胞样特性等［14］。近年来，EMT与肿瘤微环境中的免疫细胞之间的相互作用一直是研究热点，但对HCC浸润性Tregs与EMT之间的关系尚不清楚。研究报道利用Snail cDNA转染大鼠黑色素瘤细胞和脾细胞共培养可以诱导出EMT，另外还伴随着Tregs增多引起免疫耐受，促进肿瘤转移［5］。Snail是一种含锌指结构的DNA结合蛋白，可以结合E-cadherin启动子部位的E-box连接基序，抑制E-cadherin基因的表达及上调Vimentin的表达，引起上皮细胞向间质细胞表型转化，产生EMT，是关键的EMT调控因子［15］。本研究通过检测E M T标志物E-cadherin、Vimentin蛋白和Snail mRNA在HCC组织中的表达，结果显示E-cadherin表达与Vimentin和Snail表达呈负相关，证实了HCC组织中EMT现象的存在。本研究结果还显示，Tregs的数量与E-cadherin呈负相关，与Vimentin和Snail呈正相关，说明HCC组织中浸润的FoxP3+Tregs对EMT有重要影响。综上所述，HCC组织中浸润的Tregs有利于肝癌的侵袭、转移，与肝癌细胞的EMT关系密切，并且对患者预后判断有一定的参考价值，可作为治疗靶点成为控制肿瘤转移的策略之一。今后有必要通过体外实验进一步明确，在HCC中，是Tregs诱导了EMT，还是EMT激发了Tregs的免疫活性。

［1］ HUANG Y, WANG F, WANG Y, et al. Intrahepatic IL-17+ T cells and FoxP3+ Tregss cooperate to promote development and affect the prognosis of hepatocellular carcinoma［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2014, 29: 851-859.

［2］ GUO C L, YANG H C, YANG X H. Associations between infiltrating lymphocyte subsets and hepatocellular carcinoma［J］. Asian Pacific J Cancer Prev, 2012, 13 (11): 5909-5913.

［3］ 王鸿雁, 史秦峰, 孙颖, 等. 人乳腺癌组织及局部引流淋巴结中调节性T细胞分析［J］. 中华病理学杂志，2013, 42(2): 95-100.

［4］ DING W, YOU H, DANG H, et al. Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion［J］. Hepatology, 2010, 52: 945-953.

［5］ KUDO-SAITO C, SHIRAKO H, TAKEUCHI T, et al. Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells［J］. Cancer Cell, 2009, 15(3): 195-206.

［6］ DE REZENDE L C, SIKVA I V, RANGEL L B, et a1．Regulatory T cell as a target for cancer therapy［J］. Arch Immunol Ther Exp(Warsz), 2010, 58(3): 179-190.

［7］ FONTENOT J D, GAVIN M A, RUDENSKY A Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells［J］. Natu Immu, 2003, 4(4): 330-336.

［8］ DU Y, CHENX, HUANG Z M, et a1. Increased frequency of FoxP3+ regulatory T cells in mice with hepatocellular carcinoma［J］. Asian Pac J Cancer Prev, 2012, 13(8): 3815-3819.

［9］ ZHANG J Y,SONG C H，SHI F,et a1. Decreased ratio of Tregs cells to Thl7 cells correlates with HBV DNA suppression in chronic hepatitis B patients undergoing entecavir treatment［J］. PLoS One, 2010, 5(11): e13869．

［10］ ZHOU L, FU J L, LU Y Y, et a1. Regulatory T cells are associated with post-cryoablation prognosis in patients with hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma［J］. J Gastrcenterol, 2010, 45(9): 968-978．

［11］ 徐原林, 王华庆, 钱正子, 等. M2型巨噬细胞和调节性T细胞在弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中的含量及其与患者预后的关系［J］. 中华肿瘤杂志, 2013, 35(6): 450-455.

［12］ BATES G J, FOX S B, HAN C, et a1. Quantification of regulatory T cells enables the identifieation of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse［J］. J Clin Oncol, 2006, 24(34): 5373-5380.

［13］ SALAMA P, PHILLIPS M, GRIEU F, et a1. Tumor-infiltrating FoxP3+ T regulatory cells show strong prognostic significance in colorectal cancer［J］．J Clin Oncol, 2009, 27(2): 186-192.

［14］ IWATSUKI M, MIMORI K, YOKOBORI T, et a1. Epithelialmesenchymal transition in cancer development and its clinical significance［J］. Cancer Sci, 2010, 101(2): 293-299.

［15］ 黄庆, 胡荣林, 焦兴元, 等. 组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过Snail诱导肝卵圆细胞上皮-间质转化［J］. 中华肝胆外科杂志, 2012, 18(12): 926-932.

The relationship of the tumor-in fi ltrating FoxP3+Tregs with epithelial-mesenchymal transition and prognosis of hepatocellular carcinoma

XU Jun1, WANG Jian1, HU Yong1, CHENG Lan-lan1, YU Hong-

yu2
(1.Department of Pathology, the 105thHospital of PLA, Hefei Anhui 230031, China; 2. Department of Pathology, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

XU Jun E-mail: doctorxujun@163.com

Background and purpose: Tumor-in fi ltrating regulatory T cells (Tregs) play an important role in the development of various cancers, Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key step toward cancer metastasis, but the interaction between Tregs and EMT has not yet been evaluated. We aimed to investigate the relationship of FoxP3+ Tregs and epithelial-mesenchymal transition (EMT) in hepatocellular carcinoma (HCC) and to determine the clinical signi fi cance of Tregs. Methods: Seventy-four sets of patient-matched tumors and twenty sets of peritumoral tissues were obtained during curative resection for HCC. The expression of FoxP3, E-cadherin, Vimentin protein and Snail mRNA was detected by immunohistochemistry and in situ hybridization histochemistry in formalin- fi xed and paraf fi n-embedded tissues. Results: The average number of intratumoral Tregs was signi fi cantly higher than that in corresponding peritumoral tissues [9.7 (3.8-20.2) vs 1.4 (0.5-4.2), respectively; P＜0.01]. The number of intratumoral Tregs was positively correlated with potal vein tumor thrombus and microvascular invasion (P＜0.05). Increased number of intratumoral Tregs was signi fi cantly associated with decreased rates of recurrence-free and overall survival (P＜0.05, P＜0.01). There was a signi fi cant negative correlation between E-cadherin and the other EMT-related markers (Vimentin: r=-0.572, P＜0.01, Snail: r=-0.597, P＜0.01). Increased number of intratumoral Tregs was characterized by increased expression of EMT-related proteins (Vimentin: r=0.598, P＜0.01; Snail: r=0.423, P＜0.05) and loss of E-cadherinexpression(r=-0.513, P＜0.05). Conclusion: Intratumoral in fi ltration by Tregs is closely related to metastasis and EMT in HCC, FoxP3+ Tregs may be a potential prognostic indicator for HCC patients.

Hepatocellular neoplasms; Hepatocellular carcinoma; Tregs; Epithelial mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.12.006

R735.7

A

1007-3639(2014)12-0914-06

2014-07-24

2014-09-12）

徐军 E-mail:doctorxujun@163.com