HDAC1 siRNA转染对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

顾红军 董宇超 李强

1.解放军第一00医院急诊科，江苏 苏州 215007；2.第二军医大学附属长海医院呼吸内科，上海 200433

组蛋白乙酰化状态由组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）调节。HDACs在染色质重塑、基因阻遏及调节细胞周期和分化中起到重要的作用［1］。肿瘤细胞中HDACs功能异常可导致许多基因转录受抑制，从而抑制抑癌基因的表达。HDACs作用下组蛋白去乙酰化导致了染色体的空间结构紧密，抑制了基因的表达［2］。HDACs抑制剂（HDACs inhibitor，HDACi）在多项研究中表明对人非小细胞肺癌细胞株有抑制增殖和诱导凋亡作用。而HDACi对HDACⅠ型和Ⅱ型均有抑制作用［3］，非小细胞肺癌细胞株中尚未明确HDACs中HDAC1在肿瘤细胞生长中的作用。我们通过HDAC1 siRNA转染肺腺癌细胞株A549，观察HDACs中HDAC1对肺腺癌细胞增殖、周期和凋亡的影响，以进一步明确HDAC1在肿瘤细胞生长中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 乙酰化组蛋白H4（Ac-H4）小鼠抗人单克隆抗体、HDAC1小鼠抗人单克隆抗体和 β-actin单克隆抗体为美国Santa cruz生物技术公司产品。PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，HDAC1（mRNA序列号：NM_004964）：上游5’-GCCATCCTGGAACTGCTAAA-3’，下游5’-GGCTTGAAAATGGCCTCATA-3’，GAPDH：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3’。氯化丙啶（PI，美国Sigma公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术公司。Real-time PCR Master Mix为日本TAKARA生物有限公司产品。HDAC1 siRNA购自美国Ambion公司，INTERFERinTM transfection Kit 购自Polyplus-transfection公司，Opti-DMED购自美国Gibco BRL公司。HDAC1 siRNA和Negative siRNA由美国QIGEN公司设计和合成。HDAC1 siRNA序列：正义链，5’-GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT-3’；反义链，5’-UACUUUGGACAUGACCGGCTT-3’，同时设计了与其组成相同但碱基序列不同的Negative control作为阴性对照。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞株及培养条件 肺腺癌A549细胞株由中国科学院上海生物细胞研究所提供，在含10%小牛血清的PRMI 1640培养液中培养，在37 ℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度条件下生长传代，实验时取对数生长期的细胞（表1）。

1.2.2 siRNA转染A549细胞 实验分组：阴性对照组（Negative siRNA组，简称Negcontrol）、HDAC1 siRNA20 nmol/L组（简称siHDAC1）和空白对照组（简称Blankcontrol）。siRNA转染前24 h A549细胞铺板，按一定的细胞数将A549细胞分别接种于96孔板、24孔板或6孔板。转染当天取适量siRNA与无血清培养基混合，用终浓度为20 nmol/L的HDAC1 siRNA轻混匀，室温放置5 min。取相应INTERFERinTM转染剂与无血清培养基混合，轻混匀，室温放置10 s。将上述两者混匀，室温放置10 min。更换培养液，将转染复合物加到培养板或培养瓶中，轻柔摇匀，培养24 h后吸出培养基，加入含小牛血清的PRMI 1640培养液。在24 h收取细胞提取mRNA，48 h提取蛋白，每24 h换液1次，按对应时间点细胞周期、凋亡或细胞增殖检测。

表1 siRNA（20 nmol/L）转染试剂剂量比例表Tab.1 siRNA (20 nmol/L) transfection reagent dose-rate

1.2.3 逆转录合成cDNA 及Real-time PCR siRNA转染24 h后分别收集细胞，TRIzol（美国Invitrogen公司）法抽提总mRNA。Realtime PCR法检测HDAC1 mRNA表达，与内参照GAPDH比较。PCR仪为7500型（美国Applied Biosystems公司）。扩增条件为：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性15 s，60 ℃扩增15 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环，实验重复3次。计算相对表达量（RQ）=2-ΔΔCT，以对照组RQ值的均数为1，计算其他各组mRNA的相对表达量。

1.2.4 Western blot法检测 siRNA转染A549细胞36 h后分别收集细胞，抽提总蛋白；经BCA法行蛋白定量后，取30 μg蛋白行SDS-PAGE电泳分离，之后电转至硝酸纤维素膜，经5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别以Ac-H4单抗（1∶500）或 HDAC1抗体（1∶500）4 ℃温育过夜，TBS洗膜后，以HRP羊抗小鼠二抗（1∶2 000）室温轻摇2 h后，采用ECL化学发光法显影。

1.2.5 MTT法检测siRNA转染对细胞增殖抑制率的影响 A549细胞，接种于96孔培养板内，每组设6个复孔。HDAC1 siRNA转染A549细胞株12、24和48 h，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，再培养4 h后，吸弃孔内培养液，加100 μL/孔DMSO，酶标仪测定492 nm 波长处吸光度（A492），以空白对照调零。肿瘤细胞生长存活率（%）=实验组A492/空白对照组A492×100%。

1.2.6 细胞周期测定 A549细胞接种于6孔培养板，每组设3个复孔。siRNA转染A549细胞48 h后收集细胞，每孔加入预冷PBS洗涤细胞2次，加入预冷70%乙醇固定，4 ℃过夜。加入100 μg/mL的RNase 10 μL/孔， 50 μg/mL的碘化丙啶缓冲液300 μL/孔，4 ℃避光30 min，流式细胞仪（FACSCalibur，美国Becton Dickinson公司）检测细胞周期。

1.2.7 细胞凋亡测定 A549细胞接种于6孔培养板，每组设3个复孔。siRNA转染48 h后收集细胞，收集各组细胞，按照Annexin V细胞凋亡检测试剂盒说明测定细胞凋亡。

2 结 果

2.1 HDAC1 siRNA转染A549细胞株对HDAC1 mRNA表达的影响 每个样本设3个复孔，用Real-time PCR检测siRNA转染A549细胞HDAC1 mRNA相对表达的变化，通过运算得到两组的RQ值。单因素方差分析，发现HDAC1 siRNA组转染后HDAC1 mRNA表达水平为（0.23±0.05），低于Blank-control组的（1.0±0.03）和Neg-control组的（1.02±0.03）（P＜0.001），而两个对照组间相比，差异无统计学意义（P=0.42）。

2.2 HDAC1 siRNA转染肺腺癌细胞株对HDAC1蛋白和Ac-H4蛋白表达的影响HDAC1 siRNA转染A549细胞，Western blot结果显示HDAC1 siRNA组HDAC1蛋白的表达明显低于阴性和空白对照组，而Ac-H4在HDAC1 siRNA转染后表达增加（图1）。

2.3 HDAC1 siRNA转染对腺癌细胞株生长的抑制作用 以MTT法检测A549转染HDAC1 siRNA 6、12、24和48 h后与阴性对照组细胞抑制率。结果显示：HDAC1 siRNA 转染后，时间依赖性抑制A549细胞生长，在12 h时即与阴性对照组差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

图1 Western blot检测HDAC1蛋白和Ac-H4蛋白的表达Fig.1 Expression of HDAC1 and Ac-H4 detected by Western blot

表2 HDAC1转染A549细胞各组细胞存活率Tab.2 Time-effect of HDAC1 siRNA on A549 cell proliferation(%, n=6, ±s)

表2 HDAC1转染A549细胞各组细胞存活率Tab.2 Time-effect of HDAC1 siRNA on A549 cell proliferation(%, n=6, ±s)

Compared with Neg-control group, *: P＜0.05; ▲: P＜0.001.

Group t/h 6 12 48 72 Neg-contol 99.6±5.2 102.3±4.8 104.8±8.5 97.2±10.7 si HDAC1 95.2±4.3 83.6±5.3* 62.5±7.5▲ 53.4±5.7▲

2.4 HDAC1 siRNA转染对A549细胞对细胞周期影响 结果显示，A549细胞予以HDAC1 siRNA 转染48 h后，可见HDAC1 siRNA组G2/M期细胞百分率高于对照组，差异有统计学意义（P=0.015），S期明显增高（P=0.04），G0/G1期减低（P=0.02）。空白和阴性对照组间细胞周期差异无统计学意义（表3）。

表3 HDAC1 siRNA转染48 h后对A549细胞各组细胞周期影响Tab.3 Detection of the percentage of different phase cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group after 48 h(%, n=3,±s)

表3 HDAC1 siRNA转染48 h后对A549细胞各组细胞周期影响Tab.3 Detection of the percentage of different phase cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group after 48 h(%, n=3,±s)

Compared with Blank-control group, *: P＜0.05.

Group G0/G1 phase G2/Mphase S phase Blank-control 64.6±4.8 4.7±0.8 30.7±2.8 Neg-control 67.0±4.9 5.3±2.3 27.7±4.7 siHDAC1 41.0±3.8* 12.1±1.7* 46.9±3.1*

2.5 HDAC1 siRNA转染对肺腺癌细胞各组细胞凋亡率变化 检测细胞凋亡统计学分析，发现HDAC1 siRNA 转染A549细胞48 h后细胞早期凋亡增加（P＜0.001），晚期凋亡差异无统计学意义。空白和阴性对照组间细胞凋亡差异无统计学意义（表4）。

表4 HDAC1 siRNA转染后细胞凋亡率变化Tab.4 Detection of the percentage of apoptosis cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group(%, n=3, ±s)

表4 HDAC1 siRNA转染后细胞凋亡率变化Tab.4 Detection of the percentage of apoptosis cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group(%, n=3, ±s)

Compared with Blank-control group, *: P＜0.001.

Group Early phase apoptosis Late phase apoptosis Blank-control 5.01±0.41 4.93±0.87 Neg-control 5.22±0.58 5.42±1.84 siHDAC1 13.45±0.66* 5.71±1.65

3 讨 论

HDACs属于HDACs超家族，是一类具有能通过组蛋白转录后修饰来调节基因转录或调节其他转录因子的酶［4］，共有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四型。Ⅰ型HDACs包括HDAC1、2、3、8，与酵母菌的RPD3同源。Ⅱ型HDACs包括HDAC4、5、6、7、9、10，与酵母菌的HDA1同源。第Ⅲ型是酵母SIRT2类似蛋白，具有尼克酰胺腺苷酸的蛋白活性，但对于HDAC1的抑制剂不敏感；Ⅳ型HDACs是HDAC11。HDACs在染色质重塑、基因阻遏、调节细胞周期和分化中起到重要的作用［1］。肿瘤细胞中HDACs功能异常可导致许多基因转录抑制，抑制抑癌基因的表达。HDACs可被募集结合在特定的启动子区，从而导致基因转录抑制，肿瘤细胞可以通过此机制而存活。

HDACi抑制剂已被广泛应用于研究在体外肿瘤细胞和动物模型中肿瘤发展等相关基因去抑制的效果。HDACi在多项研究中表明对人非小细胞肺癌细胞株有抑制增殖、诱导凋亡的作用［5-7］。HDACi的效果更多依赖于肿瘤细胞的类别而不是所选抑制剂的类型［8］。而HDACi对HDACⅠ型和Ⅱ型均有抑制作用［3］，尚未明确HDAC1在非小细胞肺癌细胞生长中的作用。本实验用RNAi技术，沉默肺腺癌A549细胞HDAC1，观察细胞增殖、凋亡和周期，进一步明确了HDACs中HDAC1在肿瘤细胞生长中的作用。

实时荧光定量PCR和Western blot技术分别检测到HDAC1 siRNA转染A549细胞后HDAC1在转录和翻译水平的表达都明显受到抑制，说明HDAC1 RNA干扰有效。MTT法定量检测，HDAC1 siRNA转染A549后，细胞生长明显受抑制。流式细胞仪定量分析HDAC1 siRNA转染A549细胞较多积聚在G2/M期，细胞早期凋亡增加，和一定浓度下对HDACs多个靶点有作用的曲古霉素A干预得到相似的抑制肿瘤增殖效应［9］。提示HDAC1在A549细胞株增殖中起着重要的作用。真核生物染色体的基本单位是核小体，核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）各2个分子构成八聚体，DNA的146个碱基对在每个组蛋白八聚体分子的表面盘绕构成核小体。证实HDAC1基因沉默可能与组蛋白乙酰化一致，本实验予以HDAC1 siRNA转染A549后，用Western blot技术发现乙酰化组蛋白H4蛋白表达明显增高。HDAC1 siRNA转染腺癌细胞株，降低了HDAC1的表达，减少了组蛋白的去乙酰化，组蛋白H4的乙酰化增加，有利于抑癌基因的表达，使肿瘤细胞停滞在G2/M，凋亡细胞增多，是减少细胞增殖的原因。

HDAC1和HDAC2常形成异二聚体并参与组成许多蛋白复合体，如Sin3、NuRD和CoREST等［10］。许多涉及细胞周期调节、分化和发展的转录因子与HDAC1、HDAC2或HDAC1/HDAC2复合体有直接联系。siRNA转染试验证实了许多Ⅰ类HDACs成员在共抑制复合体控制的许多过程中起到重要作用。本实验运用siRNA去除HDAC1引起细胞增殖减少，凋亡增多可能是因为HDAC1 RNAi先使HDAC1 mRNA表达减少，从而影响该蛋白表达量，进而影响HDAC1参与组成的许多组分复合体的完整性和功能，从而影响肺腺癌细胞的增殖和凋亡。

HDACs的强效抑制剂曲古霉素A可抑制细胞增殖。用正常大鼠成纤维细胞研究发现：曲古霉素A可将增殖细胞特异地锁定在G1和G2期，可见G1和G2期的演进需要HDACs［11］。曲古霉素A去除后，锁定在G1期的细胞同步进入S期，而锁定在G2期的细胞不能进入M期，而是再次进入S期，形成增殖性四倍体细胞。我们观察到HDAC1低表达后A549细胞出现了G2/M期阻滞。由于G2/M期的细胞对于化疗和放疗都很敏感，因此设法使细胞停滞在G2期会提高肿瘤细胞对治疗的敏感性。HDAC1 siRNA转染引起的细胞周期锁定可能是由于其造成的组蛋白高乙酰化状态干预了细胞周期调节因子（如周期蛋白）的作用，不但可以抑制细胞的生长，还可以增加肿瘤细胞对于化疗和放疗的敏感性。

综上所述，我们认为HDAC1 siRNA 转染有效地抑制了肺腺癌细胞株中A549的HDAC1基因mRNA及蛋白的表达，增加了A549细胞中组蛋白H4的乙酰化；HDAC1 siRNA在体外能通过G2/M细胞周期阻滞有效抑制肺腺癌细胞的生长增殖，并可诱导细胞凋亡，抑制肺腺癌细胞的生长。以上实验结果证实HDAC1在肿瘤细胞生长中起着重要的作用，为基因治疗肺腺癌奠定了基础。HDAC1在肿瘤细胞增殖中的机制有待进一步研究。要明确HDACS中HDAC1在肿瘤细胞生长中是否起主要作用，可设计对不同HDACs的siRNA相应沉默其HDAC，更能准确说明之间的差异。

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