宫颈鳞癌组织中RASSF1A基因甲基化状态及其临床意义

乔玉环 王琳 刘红彦 郭瑞霞 张孝艳 赵晓丽

郑州大学第一附属医院妇产科，河南 郑州 450052

宫颈癌是威胁女性健康的第二大妇科恶性肿瘤，并呈现年轻化趋势。近年来，表遗传学的修饰在肿瘤形成过程中的作用成为目前研究的热点，主要包括DNA甲基化和组蛋白去乙酰化。DNA甲基化是哺乳动物表遗传学修饰的一种最重要形式［1］。Ras相关区域家族1A（ras associated domain family 1A，RASSF1A） 基因启动子区高甲基化与肺癌、胃癌、乳腺癌及卵巢癌等多种人类肿瘤的发生有关［2］，宫颈癌中RASSF1A基因甲基化的研究国内外亦有相关报道，但有关RASSF1A基因甲基化与RASSF1A蛋白表达之间关系的研究甚少。本研究采用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）及免疫组织化学方法检测15例正常宫颈组织和46例宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）组织中RASSF1A基因启动子区甲基化和RASSF1A蛋白的表达情况，旨在探讨RASSF1A基因甲基化与RASSF1A蛋白表达之间的关系及其在CSCC发生、发展中的作用。

1 资料和方法

1.1 研究对象 收集2008年10月—2009年12月在郑州大学第一附属医院妇科治疗的宫颈癌患者手术切除或门诊活检的新鲜标本46例。病理学类型均为鳞癌；临床分期（FIGO 2000）：Ⅰ期21例，Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期8例；组织学分级：G1～G231例，G315例；伴有淋巴结转移者5例。患者中位年龄41岁（25～67岁）。所有标本均经病理检查确诊，术前未接受放、化疗。另选取同期因子宫肌瘤行子宫全切术的正常宫颈组织15例作为对照。将每一份标本均分为两份，一份切下后立即置冰盒中，然后转入-80 ℃冰箱保存；另一份用4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，用于免疫组织化学染色。

1.2 实验方法

1.2.1 DNA提取 按常规酚-氯仿法抽提组织DNA，TE缓冲液溶解后检测DNA浓度和纯度。A260/A280均介于1.7～2.0之间，-80 ℃保存备用。

1.2.2 亚硫酸氢盐修饰及MSP检测 用Chemicon公司的CpGenomeTMDNA Modification Kit（S7820）试剂盒修饰样品DNA。引物序列设计参照参考文献［3］（表1）。PCR反应条件：95 ℃预变性9 min，95 ℃变性30 s，退火1 min，72 ℃延伸30 s，循环37次，72 ℃延伸5 min，产物4 ℃保存。取10 μL反应产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。用Sss I 甲基转移酶修饰过的胎盘组织DNA作为甲基化阳性对照，以双蒸水代替模板DNA作为阴性对照。

1.2.3 免疫组织化学 鼠抗人RASSF1A单克隆抗体（工作液浓度1∶500）购自美国Bioscience公司，ABC试剂盒购自美国Vecter公司。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。用已知的RASSF1A阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4 结果判定［4］胞质着色为棕黄色者为RASSF1A阳性，光学显微镜下选取5个视野（×400），每个视野计数100个细胞。⑴根据细胞染色强度：无显色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。⑵根据阳性细胞比例：无阳性细胞计0分，阳性细胞＜10%计1分，10%～＜50%计2分，50%～＜75%计3分，≥75%计4分。两者相乘总积分≥4分判为阳性表达。

1.3 统计处理 所有数据用SPSS 16.0软件进行处理。率的比较采用χ2检验和Fisher精确概率法，相关性检验采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05；多组总体比较后的两两比较，采用Bonferroni法对α进行校正，α=0.017。

2 结 果

2.1 RASSF1A基因的甲基化状况及其与CSCC临床病理特征的关系 15例正常宫颈组织中未见RASSF1A基因甲基化，46例CSCC组织中有20例存在RASSF1A基因甲基化，甲基化阳性率为43.5%，差异具有统计学意义（χ2=7.830，P＜0.05，图1）。CSCC患者中临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A基因甲基化率分别为19.0%、58.8%、75.0%，总体比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中，Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A基因甲基化率明显高于Ⅰ期（P＜0.017）；RASSF1A基因甲基化与CSCC的组织学分级和淋巴结转移无关（P＞0.05，表2）。

表1 RASSF1A甲基化特异性PCR引物序列、扩增片段大小及退火温度Tab.1 The MSP primers of RASSF1A and PCR parameters

图1 宫颈鳞癌组织中RASSF1A基因启动子区甲基化Fig.1 The promoter methylation of RASSF1A gene in CSCC

2.2 R A S S F 1 A蛋白的表达情况及与RASSF1A基因甲基化的关系 正常宫颈组织中均有RASSF1A蛋白的表达，而CSCC组织中蛋白阳性表达率仅为41.3%，两者比较差异具有统计学意义（χ2=15.796，P＜0.05，图2）。CSCC患者中临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的RASSF1A蛋白表达呈逐渐降低趋势（66.7%→23.5%→12.5%，P＜0.05），前者与后两者比较，差异均有统计学意义（P＜0.017）；RASSF1A蛋白的表达与组织学分级和淋巴结转移无关（P＞0.05，表2）。

表2 RASSF1A基因甲基化及蛋白表达与临床病理特征的关系Tab.2 The relationship between methylation and protein expression of RASSF1A and clinicopathological characteristics[n(%)]

Spearman等级相关分析结果显示，RASSF1A基因甲基化与RASSF1A蛋白表达之间呈负相关（r=-0.469，P＜0.05，表3）。

表3 宫颈鳞癌组织中RASSF1A基因甲基化与RASSF1A蛋白表达的关系Tab.3 The correlation between methylation of RASSF1A and expression of RASSF1A protein in CSCC(n)

图2 正常宫颈及宫颈鳞癌组织RASSF1A蛋白的表达Fig.2 The protein expression of RASSF1A in normal cervical tissues and CSCC

3 讨 论

RASSF1A是RAS相关区域家族1的主要转录本之一，位于人染色体3p21.3区域，其cDNA全长1 873 bp，编码340个氨基酸，该基因在正常组织中均有表达，而在多种肿瘤组织及肿瘤细胞系中表达缺失，是一种潜在的肿瘤抑制基因。有关RASSF1A的确切作用机制目前尚不明确，可能是通过阻断细胞周期发展、促进细胞凋亡及抗微管解聚等发挥抑制肿瘤细胞生长及转移的作用［5］。有研究表明［6］，启动子区异常甲基化是RASSF1A基因失活的最主要机制。甲基化的RASSF1A基因失去了对细胞的负向调节作用，从而使细胞更容易发生恶变。

有学者研究发现，8株宫颈癌细胞系中，有3株（37.5%）存在RASSF1A基因的高甲基化［7］。Kim等［8］用巢式MSP法检测69例韩国CSCC标本，结果发现有21例（30.4%）发生了RASSF1A基因的异常甲基化。本研究采用MSP技术检测46例CSCC组织中RASSF1A基因的甲基化阳性率为43.5%，与上述研究结果基本一致，这说明RASSF1A基因甲基化在CSCC的形成过程中可能起着重要作用，属于CSCC的一个频发事件，并具有肿瘤特异性。免疫组织化学结果发现，15例正常宫颈组织均有RASSF1A蛋白的阳性表达，而46例CSCC组织中RASSF1A蛋白阳性表达率仅为41.3%，两者比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。另外，甲基化阳性的CSCC组织RASSF1A蛋白阳性表达率明显低于甲基化阴性的CSCC组织（15.0% vs 61.5%），统计分析显示RASSF1A基因甲基化与RASSF1A蛋白表达呈负相关，提示RASSF1A异常甲基化可能是导致该基因沉默及蛋白低表达的主要因素。但在甲基化阴性的26例CSCC组织中有10例表现为RASSF1A蛋白表达缺失或低表达，这有可能说明甲基化不是导致RASSF1A基因失活的唯一因素，还存在其他分子生物学机制如杂合性丢失、纯合性缺失等，从而导致该基因的失活。

在本研究中，RASSF1A基因甲基化与CSCC的临床分期有关，且Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期的甲基化阳性率明显高于Ⅰ期，提示RASSF1A基因甲基化发生在CSCC的早期阶段，且在宫颈癌的进一步发展过程中可能起到了重要作用。另外，随着宫颈癌组织学分级的增高或伴有淋巴结的转移，RASSF1A基因甲基化程度也呈增高趋势，但差异均无统计学意义，这可能与研究样本量较小以及临床病理因素构成比例不均衡有关。综上所述，RASSF1A基因异常甲基化可能是导致RASSF1A蛋白低表达的主要机制之一，是CSCC发生的早期且频繁事件，在CSCC的进一步发展中起到了重要作用。基因甲基化与基因突变不同，既具有遗传性，又具有可逆性。Narayan等［7］用去甲基化药物5-氮-2’脱氧胞苷（5-2aza-CdR）作用于RASSF1A基因表达失活的宫颈癌细胞，发现已失活的RASSF1A基因重新恢复表达，且抑制了宫颈癌细胞的生长。这使得宫颈癌的分子靶向治疗成为可能，为探索新的治疗方法提供了思路。随着对RASSF1A基因细胞调控机制研究的不断深入以及抑癌作用的逐步明确，其在CSCC诊治方面将发挥更加重要的作用，因此有望成为CSCC早期诊断的分子生物学指标。

［1］ 黄朝晖, 杜祥.DNA甲基化在肿瘤无创性分子诊断中的研究进展［J］.中国癌症杂志,2009,19(3)：224-227.

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［3］ Spugnardi M, Tommasi S, Dammann R, et al.Epigenetic inactivation of RAS association domain family protein 1(RASSF1A) in malignant cutaneous melanoma［J］.Cancer Res, 2003, 63(7)：1639-1643.

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［5］ Richter AM, Pfeifer GP, Dammann RH.The RASSF proteins in cancer： from epigenetic silencing to functional characterization［J］.Biochim Biophys Acta, 2009,1796(2)：114-128.

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［7］ Narayan G, Arias-Pulido H, Koul S, et al.Frequent promoter methylation of CDH1, DAPK, RARB, and HIC1 genes in carcinoma of cervix uteri： its relationship to clinical outcome［J］.Mol Cancer, 2003, 2：24.

［8］ Kim JH, Choi YD, Lee JS, et al.Assessment of DNA methylation for the detection of cervical neoplasiain liquidbased cytology specimens［J］.Gynecol Oncol,2010,116(1)：99-104.