低频超声靶向微泡破坏技术的协同抗肿瘤机制研究及应用进展

牛梓涵，赵辰阳，姜玉新

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院超声医学科，北京 100730

近半个世纪以来恶性肿瘤的发病率、死亡率不断增高，在全世界范围严重威胁着人类健康。国家癌症中心发布了2015年全国368个肿瘤登记处(共覆盖人口309 553 499人)恶性肿瘤的发病率为285.83/10万，死亡率为170.05/10万，且不论城市还是农村，恶性肿瘤都是中国居民归因死亡的主要原因[1- 2]。目前临床上抗肿瘤主要方法有手术、化疗、放疗、免疫治疗，然而，每种治疗方法都有其局限性，手术治疗难以彻底治愈转移的肿瘤组织；化疗具有全身毒性、低选择性、耐受性；放疗会出现放射性皮炎、骨髓抑制等毒副作用；免疫疗法会产生皮肤、胃肠、肝等脏器毒性。随着医学技术的发展，目前提出了“精准医学”的概念，即针对肿瘤特征进行个体化、精准化治疗，可显著提高恶性肿瘤的治疗效果[3]。低频超声靶向微泡破坏技术(low-frequency ultrasound-targeted microbubble destruction，LF-UTMD)作为一种精准治疗肿瘤的方式得到发展，提高了肿瘤区域活性物质递送效率、减少了正常组织中药物的副作用。本文主要综述LF-UTMD的协同抗肿瘤的机制研究及应用进展。

LF-UTMD

低频超声(low-frequency ultrasound，LFUS)作为一种安全、非侵入性的方式在超声介导的药物输送中有巨大潜力，已经被广泛应用于肿瘤诊断治疗学[4]，一般认为用于治疗肿瘤的频率低于2 MHz，其具有穿透力强、衰减少、可聚焦深部局部组织的特点。微泡(microbubbles，MBs)是一种超声显像的造影剂，外壳由磷脂、表面活性剂、白蛋白等构成，中心填充高分子量气体，直径小于10 μm，性质稳定。经外周循环静脉注射后对肿瘤组织进行显像，最终通过肺循环代谢出体外，具有安全、无毒害等优点[4]。将LFUS与MBs相联合，即LF-UTMD，可使灌注于特定部位的微泡在超声波辐照下发生物理生物效应，使致密结缔组织和细胞膜等屏障破坏，是一种高效、无创递送外源性物质到特定部位的有效方式[5]。

LF-UTMD协同抗肿瘤的作用机制

LF-UTMD作用机制复杂，存在空化效应、热效应和机械效应，其中空化效应起重要作用。空化效应是指液体中的微小气泡(空化核)在超声波的照射下被激活，出现震荡、膨胀、收缩、崩溃等一系列动力学过程。同样，超声造影剂中MBs也可作为空化核在超声作用下被激活增强空化效应，从而产生相应生物学效应，可破坏组织屏障、提高包膜渗透性、促使局部血管破裂闭塞等[6]。空化效应的同时产生声孔效应使细胞膜表面形成微孔，直径为几至150 nm，有利于药物通过该微孔进入细胞。此外，热效应导致局部瞬态温度升高，影响磷脂双层流动性，进而影响细胞通透性[4，6- 8]。

LF-UTMD提高运转效率，促进化学、基因、免疫治疗MBs除用于检测组织灌注情况外，还可作为活性物质(如基因、药物、蛋白质等)载体，在LFUS作用下，MBs发生破裂，在提高包膜渗透性的同时，释放附着在MBs上的外源性物质，使之更易进入肿瘤组织发挥作用，通过提高转运效率增强化学、基因、免疫治疗[9]。 将纳米颗粒包裹活性物质通过物理或化学方式连接到MBs表面，或将荷载活性物质的微泡制成纳米颗粒，更有利于活性物质肿瘤部位的积累和运转。纳米颗粒具有低致病性、低免疫原性、生物可降解性等优点，可延长血液循环时间，通过高通透性和滞留效应(肿瘤微血管通透性增加和淋巴回流不良)提高肿瘤周围纳米颗粒浓度。此外，纳米颗粒的直径是细胞直径的1/60～1/60 000，有助于其进入细胞和组织内部[10- 12]。

LF-UTMD增强化学治疗：将化疗药物与微泡连接，可降低化疗药物的副作用，提高治疗效果和用药安全性[5，13]。Goertz等[14]用多西他赛(docetaxel，DTX)联合LFUS(1 MHz)对荷前列腺癌小鼠进行治疗，LFUS+MBs-DTX组在第4～6周肿瘤缩小，相对于仅LFUS+MBs组和仅DTX组，可显著抑制肿瘤生长，延长存活时间，差异具有统计学意义。UTMD因其具有无侵入性、可局部用药的特点，作为一种抗肿瘤的给药方式得到了越来越多的关注。Lentacker等[15]通过制备含阿霉素(doxorubicin，DOX)脂质体的微泡，在体外LFUS(1 MHz)照射下用于治疗黑色素瘤细胞，与DOX-脂质体相比，使用微泡负载的DOX-脂质体在杀死的黑色素瘤细胞至少要多两倍。Chen等[16]制备了负载阿霉素脂质纳米粒及其与微泡复合物联合LFUS(1 MHz)治疗荷肝肿瘤VX2新西兰兔，相比仅接受生理盐水治疗的对照组，负载阿霉素脂质纳米粒组及其与微泡复合物组细胞凋亡率增高，且与微泡复合物组细胞凋亡率明显高于负载阿霉素脂质纳米粒组，表明LF-UTMD技术提高了化疗药物转运效率，在肿瘤治疗中发挥了重要作用。

LF-UTMD增强基因治疗：MBs带正电荷脂质基团通过静电相互作用可将质粒DNA偶联到微泡表面，在UTMD作用下实现向深部肿瘤细胞特异性运送基因，同时非靶向区域中的质粒被降解，有助于提高基因转染效率[17]。Chang等[18]将微泡和wtp53质粒合成一种靶向微泡制剂，在LFUS(1 MHz)照射下，体外治疗卵巢癌细胞，结果显示与其他治疗组相比，使用LF-UTMD可使质粒转染效率增多，细胞凋亡率显著下降，差异具有统计学意义。在LF-UTMD作用下可将基因包裹于纳米微胶囊内治疗肿瘤。Sonoda等[19]体内外研究表明，在LFUS(1 MHz)作用下包裹于纳米微胶囊的绿色荧光蛋白基因转移到兔角膜细胞的含量显著增加，且没有明显的组织损伤。

LF-UTMD促进免疫治疗：免疫治疗中的免疫因子(如癌症疫苗、抗体、细胞因子等)可负载到微泡上激活免疫反应发挥抗肿瘤作用，直接攻击肿瘤细胞而不损伤正常细胞。微泡脂质体与LFUS联合应用可作为肿瘤免疫治疗的一种有效的给药方式，目前已开发出多种基于微泡脂质体纳米颗粒的药物传递系统[20]。Suzuki等[21]发现负载白介素(interleukin，IL)- 12的微泡脂质体与LFUS(1 MHz)结合能有效地将IL- 12基因导入肿瘤组织，诱导肿瘤细胞的免疫应答，显著抑制肿瘤生长。树突状细胞(dendritic cells，DCs)作为一种独特的抗原递呈细胞可有效诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)反应[22]。Oda等[23]和Suzuki等[ 24]采用外源性卵清蛋白(ovalbumin，OVA)作为抗原和微泡脂质体(bubble liposomes，BLs)制成纳米颗粒，经过LFUS(2 MHz)照射，发现OVA利用DCs抗原递呈系统直接进入细胞质作为内源性抗原诱导抗肿瘤的CTLs反应，该研究开发了一种利用BLs和LFUS将抗原导入DCs的新系统，用于基于DCs的癌症免疫治疗。

LF-UMMD技术可以增加药物、基因、抗体和细胞因子等转运效率，降低对正常组织的损伤，增强化学、基因、免疫疗法，在癌症免疫治疗中具有巨大潜力。

LF-UTMD抑制肿瘤新生血管生成，增强抗血管治疗与正常细胞相比，肿瘤细胞快速增殖(直径超过100～200 μm)需要新生血管提供充足的氧气和营养，在各种细胞因子共同作用下肿瘤组织生成发育不成熟、结构不规则的新生血管，使肿瘤组织易于缺氧和坏死，增加肿瘤的恶性程度，降低治疗效果。1972年福克曼提出抗血管治疗，通过抑制新生血管可减少肿瘤细胞的增殖[25- 27]。UTMD导致肿瘤新生血管形成局部血栓、毛细血管不可逆性扩张、细胞间质水肿，为抗血管治疗提供了一种物理途径[28]。Liu等[29]使用LFUS(831 KHz)治疗大鼠Walker 256肿瘤，超声造影结果显示当声强为4.8 MPa时，肿瘤组织循环可以完全阻断24 h，组织学显示肿瘤微血管系统弥漫性血管破坏。

内载抗血管生成药物的微泡与超声空化治疗同时使用可增强抗肿瘤效果。Zhang等[30]和Huang等[31]探讨同时给予抗血管生成药物和LFUS(238 KHz)对人结肠癌(细胞株HT29-GFP)小鼠模型的疗效，结果显示LFUS照射下裸微泡对肿瘤的抗血管作用仅持续7 d后血流恢复正常，但使用连接抗血管药物恩度的微泡联合UTMD治疗未见血流恢复，对肿瘤生长的抑制作用大于裸微泡，表明LF-UTMD可增加抗血管生成药物的药理活性，增强治疗效果。

因此，LF-UTMD为抗血管治疗提供了一种新的、简便的物理方法。

LF-UTMD在抗肿瘤中的应用进展

LF-UTMD技术应用于声动力治疗1989年，Yumita等[32]观察到血卟啉在超声作用下具有细胞毒性作用。Umemura等[33]于1992年提出了“声动力治疗”这一术语来描述卟啉在超声空化效应下的毒性作用。近年来很多研究通过体内和体外实验证实声动力治疗(sonodynamic therapy，SDT)在肿瘤治疗中有广阔的前景[8]。UTMD作用于相关物质可释放活性氧(reactive oxygen species，ROS)杀死肿瘤细胞，这类物质称为声敏剂。声敏剂在UTMD作用下吸收能量发生电子跃迁，从低能态激发到高能态，当电子回到低能态时，释放出大量ROS，可使肿瘤细胞膜破坏、线粒体肿胀和染色质凝集[8]。Wang等[34]使用低频超声(1.43 MHz)照射原卟啉IX治疗荷肝癌(H- 22)实体瘤小鼠，15 d后肿瘤体积抑制率为53.84%，处死小鼠后计算肿瘤重量抑制率为45.86%。

SDT常用的声敏剂有无机声敏剂和有机声敏剂两种，将声敏剂包裹或连接在纳米颗粒上可改善有机声敏剂疏水性、延长血液循环时间[10]。有研究使用LFUS(1 MHz)照射载有新型声敏剂微泡复合物对乳腺癌细胞进行治疗，体外实验中载有新型声敏剂微泡复合物联合LFUS可显著改变细胞形态，促使线粒体损伤、细胞凋亡，体内实验可明显抑制肿瘤生长[35]。

因此，LF-UTMD技术可实现SDT，并在抗肿瘤中发挥巨大作用。

多功能载体协同治疗在抗肿瘤中的应用进展由于肿瘤具有复杂性、多样性和异质性，目前临床研究的趋势已逐渐从单一治疗转向协同治疗，以提高治疗效果。协同治疗即联合两种或两种以上的治疗方式，可产生显著的超相加效应(即“1+1>2”)[36]。近年来，纳米材料除具有高转运率、高效药物荷载率的特点外，还可将多种类型的治疗剂通过物理吸附和化学结合力组装在一起，形成多功能纳米颗粒，为协同治疗的实现构建一体化平台[37]。

以声敏剂、微泡为基础，联合化疗药物、基因、免疫因子、抗血管药物构建多功能纳米颗粒，可实现SDT+化疗/基因/免疫/抗血管协同治疗。McEwan等[38]将声敏剂玫瑰红(rose bengal，RB)和化疗药物5-氟尿嘧啶连接到内芯为氧气的MBs表面，在LFUS(1 MHz)照射下对人胰腺癌模型(BxPc- 3)进行体内外治疗，结果显示相比于仅RB组、仅MBs组和含六氟化硫MBs-RB组，含氧MBs-RB组治疗效果显著，含氧MBs-RB在通过增加肿瘤附近氧气输送量促进ROS生成的同时，SDT和化疗联合运用也显著提高了肿瘤的治疗效果。高慧洁等[39]将化疗药物多西环素联合声敏剂Ce6在LFUS(1 MHz)照射下体外对人乳腺癌MDA-MB- 231细胞进行治疗，相比对照组，SDT联合化疗药物对肿瘤细胞的增殖具有显著的抑制作用。

此外，在SDT基础上可联合其他非侵入性治疗，如光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)、光热治疗(photothermal therapy，PTT)，从而构建致敏剂(声敏剂/光敏剂/热敏剂)+药物/基因/免疫因子/抗血管药物的多功能纳米颗粒，实现SDT/PDT/PTT+化疗/基因/免疫/抗血管治疗的协同治疗。 Zhao等[40]制备负载小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid，siRNA)、卟啉的微泡，在LFUS(1.03 MHz)和激光照射下治疗乳腺癌，卟啉被激活实现SDT、PDT，同时siRNA下调叉头框架蛋白A1(forkhead-box protein A1，FOXA1)的表达，从而抑制雌激素依赖性乳腺癌细胞的增殖、实现基因治疗，相对于单独疗法，SDT+PDT+基因治疗大大提升了对乳腺癌的治疗效果。Miyoshi等[41]使荷鳞状细胞癌小鼠口服两种增敏剂，0.2% 二氧化钛纳米粒子用于SDT和1 mmol/L 5-氨基乙酰丙酸用于PDT，相比单一治疗组，SDT联合PDT组ROS产生最多，肿瘤活性显著下降，对肿瘤治疗效果最强。Nomikou等[42]研制了一种具有声敏剂、光敏剂双重效果的由血卟啉和吲哚菁绿构成的多功能生物可降解纳米颗粒，研究表明相比单一治疗组，在低频超声(1 MHz)和激光联合作用下该纳米颗粒产生的活性氧显著上升、肿瘤细胞活力显著下降。Han等[43]研究显示氧缺乏黑钛可作为同时声动力治疗和光热治疗的纳米制剂，体外细胞水平和体内荷瘤小鼠异种移植瘤的系统评价表明SDT(1 MHz)和PTT具有很高的协同效应，可实现肿瘤的完全根除且无明显的复发，证明PTT与SDT联合应用在肿瘤治疗中的优越性。

低频超声作为一种非侵入性、安全的治疗方式在癌症治疗中显示出巨大的潜力。低频超声靶向微泡破坏技术通过空化效应、机械效应和热效应提高包膜通透性，增强药物、基因、免疫治疗；通过物理方式破坏肿瘤新生血管系统，增强抗血管治疗法。此外，低频超声靶向微泡破坏技术可激活相关致敏物质实现声动力治疗，通过释放活性氧局部精准杀伤肿瘤细胞。纳米技术的快速发展使多种类型的治疗剂通过物理吸附和化学结合力组装成多功能纳米颗粒，可产生显著的超相加效应，为实现多模态协同治疗奠定了基础，协同治疗在抗肿瘤中发挥了巨大作用。低频超声靶向微泡破坏技术为肿瘤靶向治疗提供了新思路，具有广阔应用前景。