α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞P糖蛋白表达与功能的影响

袁斯远，孙 金，刘金民

1北京中医药大学第三附属医院脑病科，北京 100029 2北京中医药大学东方医院脑病科，北京 100078

1995年，Tishler等[1]针对耐药性癫痫发病机制提出多药转运体假说，认为癫痫反复发作或长时间服用抗癫痫药物能够引起癫痫患者血脑屏障中多药耐药基因(multidrug resistance gene，Mdr)1a mRNA与其编码的P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)高表达，高表达的P-gp可通过水解ATP获取能量，将抗癫痫药物(anti-epileptic drugs，AEDs)逆浓度梯度外排出脑组织，降低脑组织中抗癫痫药物的浓度，引起癫痫耐药性[1]。

目前第3代AEDs已投入临床使用，临床上约有30种AEDs。然而，由于AEDs研发延用的是以往癫痫动物模型，新研发的AEDs药效机制进展较少，因此临床上耐药性癫痫产生率并没有随着新一代AEDs投入临床使用而有所下降，仍有30%左右[2]。2010年，国际抗癫痫联盟对耐药性癫痫的定义达成以下共识：(1)AEDs治疗的结局分类：临床无发作、治疗失败及不确定；(2)在治疗失败的基础上提出了耐药性癫痫的核心定义：两种正确选择、可耐受的AEDs，经足够疗程及剂量药物治疗(单药或联合用药)仍未能控制发作的癫痫[3]。耐药性癫痫的主要特征是癫痫患者对多种AEDs产生了不同程度的耐药性，从而降低了AEDs疗效。因此，逆转耐药、增敏AEDs是改善耐药性癫痫疗效的重要突破口。

我们前期动物实验研究发现，中药复方柴贝止痫汤(柴胡、浙贝母、法半夏、天麻、石菖蒲、地龙、牡蛎)能够下调耐药性癫痫大鼠模型海马与皮层中高表达的P-gp 与Mdr1a mRNA[4- 6]。依据现代生物方剂分析药理研究策略的指导，我们采用液相色谱-质谱(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)技术对柴贝止痫汤成分血浆动力学浓度进行检测，发现α细辛醚为柴贝止痫汤主要吸收入血效用成分之一，推测α细辛醚可能是柴贝止痫汤药效物质基础之一[7- 8]。α细辛醚为中药石菖蒲主要挥发油成分之一，石菖蒲芳香开窍，为中医脑病临床常用的引经药。在中医“芳香开窍”的理论指导下，有学者已经证明石菖蒲、石菖蒲挥发油组分以及α细辛醚皆能够下调人结直肠腺癌耐药细胞系Caco- 2上P-gp与Mdr1a mRNA的表达[9-10]。基于以上研究背景，本研究通过采用L-谷氨酸刺激大鼠脑微血管内皮细胞，制造P-gp/Mdr1a高表达细胞模型，观察了α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞中P-gp与Mdr1a mRNA表达与功能的影响。

材料和方法

材料大鼠脑血管内皮细胞购自美国ScienCell Research Laboratories，α细辛醚(2883- 98- 9，美国Sigma公司)。DMEM高糖培养基(12100- 038，美国Gibco公司)，胎牛血清(10099- 141，美国Gibco公司)，Ⅱ型胶原酶(C6885，美国Sigma公司)，0.25%胰酶-EDTA(T4049，美国Sigma公司)，L-谷氨酸(G8415，美国Sigma公司)，青霉素(0242，美国Amresco公司)，链霉素(0382，美国Amresco公司)，内皮细胞生长支持物(E2759，美国Sigma公司)，A型明胶(G2625，美国Sigma公司)，纤连蛋白(8248，美国ScienCell公司)，细胞冻存液(0133，美国ScienCell公司)，浓缩胶缓冲液(B1003)、分离胶缓冲液(B1004)、30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(B1000)、四甲基乙二胺(TEMED，A1006)购自北京普利莱基因有限公司；TRIzol试剂(15596026，美国Invitrogen公司)；逆转录cDNA试剂盒(K1622，美国Fermentas公司)；SYBR Green Real Time PCR MasterPlus(QPK- 212，日本TOYOBO公司)，PCR 引物由上海 Invitrogen 公司合成。450 型自动酶标分析仪(美国 BioRad 公司)。兔抗人 P-gp[EPR10363]单克隆抗体购自美国Abcam 公司，鼠抗人β-actin 单克隆抗体、山羊抗兔 IgG/辣根酶标记抗体、山羊抗小鼠 IgG/辣根酶标记抗体均购自北京中杉金桥生物公司。酶联免疫检测仪为美国 Thermo Fisher公司生产，PCR 仪、凝胶成像系统、垂直电泳系统、蛋白转印系统均为美国 BIO-RAD 公司生产。MTT与罗丹明 123(Rh123)均购自北京 Solarbio公司。DMSO(二甲基亚砜，美国 Sigma公司)。

大鼠脑微血管内皮细胞的培养细胞培养前1 d将75 cm2培养瓶用DPBS缓冲液清洗3次后，加入10 ml DPBS、150 μl纤连蛋白，放入5% CO2、37℃细胞培养箱中，第2天接种细胞前，吸出液体，DPBS缓冲液清洗3次后，用于接种细胞。于包被好的75 cm2培养瓶中加入12 ml完全培养基(1%P/S solution、1%ECGS、5% FBS、93% ECM基础培养基)后，迅速加入复苏了的血管内皮细胞，以减少细胞损失。将培养瓶放入5% CO2、37℃细胞培养箱中静置培养，静置大于16 h之后第1次换液(去除细胞冻存液)，吸出原培养液后弃掉，用DPBS缓冲液清洗3次，后加入12 ml完全培养基。每2～3 d换液1次。培养大约7～10 d后，细胞可生长至铺满瓶底80%～90%，即可进行传代或用于实验。

P-gp/Mdr1a高表达细胞模型的建立参考文献[11- 13]及前期预实验结果，将正常的脑微血管内皮细胞按4×104/ml密度接种至明胶包被的96孔板内，待细胞爬满板底的80%左右后，加入100 μmol/L的L-谷氨酸刺激30 min，建立P-gp/Mdr1a高表达的脑微血管内皮细胞模型。

α细辛醚对内皮细胞生长活力的影响将正常脑微血管内皮细胞分为模型组和α细辛醚干预组(12.5、25.0、50.0 μg/μl)，每组4个复孔。将正常的脑微血管内皮细胞按4×104/ml密度接种至明胶包被的96孔板内，待细胞爬满板底的80%左右后，加入100 μmol/L的L-谷氨酸刺激30 min后，使用不含谷氨酸培养基继续培养，其中模型组加入完全培养基，干预组加入含不同浓度α细辛醚的完全培养基，24 h后MTT法检测490 nm处的吸光值。与实验孔平行设不加细胞只加培养基的空白调零孔。实验重复3次。

Western blot检测细胞P-gp表达将细胞按密度1×105/ml接种至明胶包被的6孔板中培养，待细胞爬满板底80%左右，分设正常组、模型组、α细辛醚干预组，每组3个复孔。模型组加入100 μmol/L的L-谷氨酸作用30 min后换用完全培养基，药物干预组经100 μmol/L的L-谷氨酸作用30 min后换用含不同浓度α细辛醚的完全培养基(12.5、25.0、50.0 μg/μl)，正常组加入等量的完全培养基，24 h后收集并裂解细胞，Bradford法测定蛋白浓度，调节各样本蛋白浓度至5 μg/μl。SDS-PAGE电泳，每孔上样15 μl，160 V恒压25 min，100 V恒压90 min；295 mA恒流120 min转印蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭90 min，一抗标记4℃过夜(P-gp 1∶50稀释，GAPDH 1∶500稀释)，HRP-二抗(1∶2000稀释)标记80 min，ECL发光液显影，灰度值分析采用Image J软件[14-15]。

Real-time PCR检测细胞Mdr1a mRNA、Mdr1b mRNA的表达分组同前，总RNA提取采用TRIzol试剂，cDNA的合成采用Fermentas公司逆转录试剂盒，引物合成：(1)Mdr1a引物：Forward 5’-TTT CAA AGG TTG TAG GGG- 3’，Reverse 5’-CAA TGT ATC GGA GTC GC- 3’；(2)GAPDH引物：Forward 5’-GTG CCA GCC TCG TCT CAT AG- 3’，Reverse 5’-CTT TGT CAC AAG AGA AGG CAG- 3’。扩增程序：90℃ 60 s→(95℃ 15 s→56℃ 15 s→72℃ 45 s)×40次循环。扩增结果釆用2-△△Ct方法进行数据的相对定量分析，比较各组间目的基因的差异。选择模型组作为参照，其他各组目的基因mRNA的表迖与模型组的差异倍数用2-△△Ct来表示。△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct内参，△△Ct=△Ct试验组目的基因-△Ct对照组目的基因。2-△△Ct误差通过△△Ct加上标准差和△△Ct减去标准差来评估。

罗丹明 123 转运实验脑血管内皮细胞经同上干预后，继续加入5 μmol/L 罗丹明123(rhodamine 123，Rh123)于5%CO2、37℃细胞培养箱中作用90 min。Rh 123作用后，置冰上终止作用，4℃离心弃去上清液，冰冷的 PBS 洗 2次，4℃离心弃去上清液，细胞重悬于 0.5 ml PBS 液中，采用多功能酶标仪测定细胞内Rh123的荧光值。荧光激发波波长为 485 nm，发射波波长为 535 nm。

统计学处理采用SPSS 23.0统计软件，实验结果以均数±标准差表示，组间均数比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞生长活性的影响MTT检测结果显示，100.0 μmol/L谷氨酸与12.5(F=7.134，P=0.838)、25.0(F=7.134，P=0.798)、50.0 μg/μl(F=7.134，P=0.925)α细辛醚干预24 h后，大鼠脑微血管内皮细胞的存活率分别为96.7%、98.5%、96.1%、98.3%，与空白对照组细胞的存活率差异无统计学意义；100.0 μg/μl α细辛醚干预后为70.6%，明显低于空白组(F=7.134，P=0.029)。

α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达的影响100.0 μmol/L L-谷氨酸作用30 min后，模型组大鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达较正常对照组显著升高(F=1.924，P=0.020)。在α细辛醚干预，12.5 μg/μl组P-gp的表达较模型组下降，但差异无统计学意义(F=1.924，P=0.095)；25.0(F=1.924，P=0.025)和50.0 μg/μl组(F=1.924，P=0.035)P-gp的表达均较模型组显著下降(图1)。

α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞Mdr1a mRNA表达的影响100.0 μmol/L L-谷氨酸作用30 min后，模型组Mdr1a mRNA的相对表达量为5.26，明显高于正常对照组的1.00(F=1.788，P=0.019)；正常对照组的表达为模型组的0.19倍。25.0 和50.0 μg/μl α细辛醚干预组Mdr1a mRNA的相对表达量分别为3.63(F=1.788，P=0.017)和2.10(F=1.788，P=0.026)，均明显低于模型组，分别为模型组的0.69倍和0.40倍。12.5 μg/μl α细辛醚干预组Mdr1a mRNA的表达较模型组下降，但差异无统计学意义(F=1.788，P=0.084)。

与对照组相比，aF=1.924，P=0.020；与100.0 μmol/L谷氨酸组相比，bF=1.924，P=0.025；cF=1.924，P=0.035
aF=1.924，P=0.020 compared with control group；bF=1.924，P=0.025；cF=1.924，P=0.035 compared with 100 μmol/L glutamine group
图1α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达的影响
Fig1Effect of α-asarone on the P-gp expression of rat brain microvascular endothelial cells

α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞Rh- 123 转运的影响Rh123转运实验检测结果显示，25.0和50.0 μg/μl作用于大鼠脑微血管内皮细胞24 h 后，大鼠脑微血管内皮细胞内Rh123的荧光指数分别为0.633±0.057(t=6.085，P=0.000)和0.758±0.062(t=8.912，P=0.000)，均明显高于模型组的0.401±0.074，升高率分别接近40%与60%；12.5 μg/μl组荧光指数为0.484±0.055，与模型组差异无统计学意义(t=2.225，P=0.052)。

讨 论

P-gp 为ATP 结合盒超家族蛋白(ATP-binding cassette，ABC)成员，相对分子质量约为170 000。人体中P-gp主要由位于人类第7号染色体 q21.1的MDR 1和2编码[16]，而啮齿类动物则有mdr1a、mdr1b和mdr2 3个基因可编码P-gp[17]，其中，人体的MDR1与啮齿类动物的mdr1a和mdr1b功能相同，编码P-gp参与多药耐药。而MDR2与mdr2则主要表达胆小管胆碱转运蛋白[17-18]。P-gp主要表达于肠道、肝脏、肾脏、血脑屏障以及血胎盘屏障等各类屏障与代谢器官中[19-20]。在正常脑组织中，P-gp主要表达于血脑屏障脑血管内皮细胞与血脑脊液屏障脉络丛上皮细胞中[21]。生理状态下 P-gp 起到阻止外源性毒素入侵，排出内源性有毒物质，维持内环境稳定的作用，是人体中重要的防御机制[22-23]。

研究表明，长期使用AEDs和反复的痫性发作能够引起脑微血管内皮细胞膜上P-gp表达升高[24-25]，造成癫痫患者对多种抗癫痫药物耐药，其病理机制主要为反复痫性发作造成谷氨酸在细胞外过量释放，激活血脑屏障上的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体，引起环氧合酶- 2(cyclooxygenase- 2，COX- 2)表达增加，通过Glu/NMDA receptor/COX- 2信号通路上调P-gp的表达，并促进P-gp转运[23- 25]。本研究将大鼠脑微血管内皮细胞暴露在高剂量谷氨酸环境中，模拟癫痫反复发作引起的细胞外谷氨酸升高，进而通过活化NMDA受体及COX- 2上调P-gp表达；用于探讨α细辛醚对大鼠脑微血管内皮细胞P糖蛋白表达与功能的影响。

α细辛醚为中药石菖蒲挥发油成分之一。早在20世纪80年代，有学者从石菖蒲中提取分离出α细辛醚并且推断其为石菖蒲的主要效用成分之一。自此，α细辛醚药理学作用被广泛研究。实验显示其可用于癫痫、抑郁、焦虑、阿尔茨海默病、帕金森、失眠以及高血脂等疾病的治疗。并且其广泛的药理学作用主要取决于多种生物活性，例如抗惊厥、镇静、神经保护、抗氧化、抗炎以及降血脂等[26- 30]。

在中医“芳香开窍”的理论指导下，研究人员发现中药石菖蒲、石菖蒲挥发油组分以及α细辛醚皆能够下调人结直肠腺癌耐药细胞系Caco- 2上P-gp与Mdr1a mRNA的表达[9-10]。本实验以L-谷氨酸诱导的P-gp/Mdr1a高表达的大鼠脑微血管内皮细胞为研究对象，使用α细辛醚干预24 h后，发现25.0和50.0 μg/μl α细辛醚干预的大鼠脑微血管内皮细胞中P-gp和Mdr1a mRNA表达量显著下降。此外，为了进一步证实是否大鼠脑微血管内皮细胞中P-gp的功能亦随着α细辛醚干预而下降，我们进行了Rh- 123转运实验。由于P-gp能够特异性转运荧光染料Rh- 123，抑制其进入胞内，因此Rh- 123被广泛地运用于P-gp转运功能的评价[31- 32]。本研究结果表明，经α细辛醚干预后的大鼠脑微血管内皮细胞胞内Rh- 123累积量也显著增加。以上结果表明，α细辛醚不仅能够扭转大鼠脑微血管内皮细胞P-gp的高表达，而且能够抑制P-gp转运功能。因此，α细辛醚可能能够扭转P-gp介导的癫痫耐药性。

我们前期动物实验研究发现中药复方柴贝止痫汤(柴胡、浙贝母、法半夏、天麻、石菖蒲、地龙、牡蛎)能够下调耐药性癫痫大鼠模型海马与皮层中高表达的P-gp 与Mdr1a mRNA[4- 6]。α细辛醚作为柴贝止痫汤主要吸收入血效用成分之一，能够下调P-gp表达和抑制P-gp功能的效用，表明α细辛醚可能为复方柴贝止痫汤扭转耐药性癫痫的药效学基础。此外，α细辛醚作为中医经典 “开窍药”石菖蒲主要活性成分之一，具有下调P-gp表达和抑制P-gp功能的效用，可能暗示着中医“开窍”法与血脑屏障的通透性之间存在着一定的科学联系。然而本研究也存在以下局限性：有关α细辛醚对P-gp功能的影响需要进一步动物和临床实验证实；有关α细辛醚下调P-gp表达的确切机制则需要分子生物学实验进一步的探究。