TWIK相关酸敏感K+通道- 1基因rs1275988与rs2586886位点GG基因型是发生重度阻塞性睡眠呼吸暂停的潜在危险因素

张德莲，史 甜，姚晓光，李 梅，木拉力别克·黑扎提，李秀芳，闻 璐，姚 灵，贺媛媛，汪迎春，洪 静，李南方

新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心新疆高血压研究所，乌鲁木齐 830001

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea，OSA)是由于睡眠期间咽部肌肉塌陷，反复出现呼吸暂停或口鼻气流量明显下降，临床上主要表现为睡眠时打鼾、频繁的呼吸中断以及白天嗜睡和精神恍惚。OSA是高血压发病的独立危险因素，可促进冠心病、脑卒中、心律失常、心力衰竭等疾病的发生发展[1]。但OSA的发病机制尚不完全清楚，有研究报道该病有一定的家族聚集性，受到遗传和环境因素的共同作用[2]。

K+通道是一种广泛存在于细胞膜上的K+选择性通道蛋白质复合体，这类通道在维持细胞内外K+稳态、维持细胞静息电位、膜兴奋性以及膜复极化率等方面起关键作用[3]。弱整流型漏K+通道家族是近些年新发现的K+通道，此类通道为双孔K+通道。近年研究发现，TWIK相关的酸敏感K+通道- 1(TWIK-related acid-sensitive K+channel-1，TASK- 1，也称KCNK3)基因是双孔K+通道家族的重要一员，它对缺氧和细胞外pH极为敏感，目前对其研究主要集中在细胞学实验和动物实验。研究认为，TASK- 1在大鼠呼吸中枢表达量的增加可能参与了OSA的发生，间歇性缺氧伴高碳酸血症可上调TASK- 1的表达[4- 5]。Mulkey等[6]研究发现，在整个中枢神经系统中，TASK通道转录表达是非常广泛的，有助于调节众多细胞类型的兴奋性，包括许多中枢呼吸相关神经元。目前直接和间接证据表明，钾通道的激活在睡眠调节中起着关键作用[7- 8]。睡眠-觉醒周期和睡眠结构，尤其是快速眼动睡眠期(rapid eye movement，REM)，也可能受到神经元K+传导的影响[9- 10]。低血钾是临床上常见的电解质紊乱，有激素分泌异常、利尿剂使用不当和K+摄入量低等多种发病机制。K+有保持神经肌肉系统正常的功能，研究证实呼吸肌受累的神经肌肉疾病患者在睡眠期间，特别是在REM要比在觉醒期间存在更严重的呼吸障碍[11]。研究发现，K+水平异常的患者白天有更多的自述性嗜睡、睡眠相关的幻觉和噩梦等[12]，K+水平的变化可能会影响睡眠结构和REM睡眠[13]。根据我们中心前期的研究数据显示，低钾血症可能会干扰高血压患者的睡眠结构，进一步推测K+在睡眠呼吸暂停的发生发展中可能发挥一定作用。基于以上研究证据，OSA的主要临床表现为低氧血症和高碳酸血症，与酸敏感K+通道TASK- 1基因生理机制相似，故本研究主要通过评估人群中TASK- 1基因rs1275988和rs2586886基因多态性与OSA的相关性，探讨OSA的发病机制。

对象和方法

对象2016年4月至12月首次就诊新疆自治区人民医院高血压诊疗研究中心及睡眠中心的18岁以上患者。纳入标准：伴有以下症状至少1条者，参考我中心前期研究方法学部分：(1)夜间打鼾；(2)呼吸暂停和憋醒、白天嗜睡；(3)晨起头痛；(4)血压不易控制稳定；(5)肥胖；(6)不可解释的口唇发绀等[14]。排除标准：(1)中枢性睡眠呼吸暂停综合征；(2)吸烟及患有哮喘、急慢性阻塞性肺疾病、间质性肺疾病、肺结核等呼吸系统疾病；(3)恶性肿瘤、急性感染及自身免疫性疾病；(4)急性心脑血管疾病(<6个月)；(5)近期服用类固醇、支气管扩张、抗组胺及抗炎药物应用史；(6)甲状腺功能异常；(7)多导睡眠监测(polysomnography，PSG)当晚睡眠效率低于65%及不能成功完善PSG者；(8)严重心、肾功能不全，精神疾病，肾性高血压，肾血管性高血压，嗜铬细胞瘤，醛固酮腺瘤，Cushing综合征等其他常见继发性高血压，严重睡眠障碍等。所有受试者均进行PSG，采集所有受试者的临床资料与血液样本。根据临床表现、查体及PSG结果，确诊重度OSA[呼吸暂停-低通气指数(apnea-hypopnea index，AHI)≥30次/h，AHI为平均每小时呼吸暂停和低通气是的次数之和]患者164例，非OSA(AHI<5 次/h)患者171例。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

PSG监测睡眠监测采用澳大利亚 Compumedics 公司生产的 44 道睡眠监测仪。软件为Profusion PSG睡眠分析软件，监测项目包括脑电图、颌下肌电图、眼动电图、鼻口气流、胸腹运动、血氧饱和度、心电图、腿动、体位，均完成1夜7 h以上的睡眠监测。所有研究对象监测前禁饮用茶、咖啡等饮料，避免使用镇静催眠药物。记录AHI、呼吸暂停指数(apnea index，AI)、低通气指数(hypopnea index，HI)、最低血氧饱和度(lowest oxyhemoglobin saturation，LSaO2)、平均血氧饱和度(mean arterial oxygen saturation，MSaO2)、氧减指数 3%(oxygen desaturation index of 3%，ODI3)、氧减指数 4%(oxygen desaturation index of 4%，ODI4)和血氧饱和度<90%的睡眠时间(total sleep time with oxyhaemoglobin saturation at < 90%，TST90)等指标。睡眠分期根据当前判定标准分为睡眠1期、睡眠2期、睡眠3期、睡眠4期和快动眼睡眠相(rapid eye movement，REM)，总睡眠时间的计算为前述各期的总和，睡眠各期占睡眠总时间的比例表述为睡眠各期的睡眠时间百分比。数据由1名获得美国睡眠医学会认证的睡眠技术人员进行分析。OSA严重程度根据AHI来评估[15]，AHI定义为睡眠期间每小时平均出现的暂停和低通气数。研究对象根据AHI分为非OSA组(AHI<5 次/h)和重度OSA组(AHI≥30次/h) 两组。

资料收集收集患者年龄、性别、民族、既往史及现病史(高血压家族史、病程、新入院收缩压、舒张压、血管危险分层)、个人史(包括是否打鼾及吸烟、饮酒情况)、体质量指数(body mass index，BMI)、颈围、腹围。

临床生化指标与DNA提取所有初筛对象于完成 PSG 次日采集空腹(空腹10 h后)外周静脉血(肘静脉血样)标本等量2份，其中1份60 min内4℃ 3000 r/min(r=13.5 cm)离心10 min后收集血清，-20℃储存备用。一般生化指标(包括血常规、尿常规、血沉、血脂、空腹血糖、肾功、电解质、超敏C反应蛋白、糖化血红蛋白)均由新疆维吾尔自治区人民医院检验科采用同批次试剂盒检验完成。冷藏血细胞标本取3 ml置于EDTA管中，采用PAXgene Blood DNA kit试剂盒提取基因组DNA，采用分光光度仪检测其浓度、纯度，保证DNA质量及完整性(提取的DNA -80℃保存备用，浓度及纯度要求：浓度在100 ng/μl以上，A260/A280值在1.7～1.9之间最好；储存条件：-20℃以下保存)。

单核苷酸多态性选择和分型单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)选择标准如下：(1)从 HaploView软件中筛选出TASK- 1基因的SNP，共收集到11个SNP。根据连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)系数R2>0.8和最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)≥0.05选择TagSNP；(2)SNP突变导致氨基酸改变根据dbSNP(https：//www.NCBI.NLM.nih.gov/Projects/snp/)获得；(3)国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)关键字搜索以下研究术语(TWIK相关酸敏感钾通道- 1或TASK- 1或KCNK 3)和(基因或多态性或变异或等位基因)，最后筛选出2个常见的基因位点rs1275988和rs2586886，利用竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive allele specific PCR，KASP)基因分型系统进行基因型鉴定。

统计学处理采用SPSS 19.0 统计软件，不符合正态分布的计量资料以M(Q1，Q3)表示，组间比较采用两独立样本Mann-WhitneyUtest非参数检验；基因型和等位基因频率采用直接计数法计算，Hardy-Weinberg平衡检验采用χ2检验，组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验。采用SNPAlyze V8.1.1程序比较单体型在病例组和对照组间频率分布是否存在差异[16]。采用多变量Logistic回归分析方法，计算OR和95%CI。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

重度OSA组和非OSA组临床资料的比较重度OSA组中男性患者(χ2=43.479，P<0.001)、吸烟(χ2=24.974，P<0.001)、饮酒比例(χ2=13.331，P<0.001)，中位BMI(Z=-9.109，P<0.001)、腹围(Z=-9.659，P<0.001)、颈围(Z=-10.135，P<0.001)三酰甘油(Z=-5.280，P<0.001)和总胆固醇(Z=-2.535，P=0.011)均明显高于非OSA组，而高密度脂蛋白明显低于非OSA组(Z=-4.367，P<0.001)；两组在年龄(Z=-1.616，P=0.106)、血清钾(Z=-0.908，P=0.364)、24 h尿钾(Z=-1.420，P=0.156)、尿pH值(Z=-0.244，P=0.807)、收缩压(Z=-1.307，P=0.677)和舒张压(Z=-2.049，P=0.521)方面差异无统计学意义(表1)。

表1 重度OSA组和非OSA组间临床资料的比较Table 1 Camparisons of clinical characteristics in patients with severe OSA and non-OSA individuals

OSA：阻塞性睡眠呼吸暂停
OSA：obstructive sleep apnea

TASK- 1基因多态性不同模型在非OSA组及重度OSA组分布频率的比较非OSA组和重度OSA组之间rs1275988和rs2586886两个位点基因型(AAvs. GAvs. GG)(χ2=2.767，P=0.251；χ2=3.091，P=0.213)、等位基因(Gvs.A)(χ2=2.278，P=0.131；χ2=1.417，P=0.234)、隐性模型(GG+GAvs.AA)(χ2=2.606，P=0.106；χ2=3.072，P=0.080)及显性模型(AA+GAvs.GA)(χ2=0.920，P=0.337；χ2=0.239，P=0.625)的分布差异无统计学意义(表2)。

TASK- 1基因多态性不同模型在血钾分层中非OSA组及重度OSA组分布频率的比较当血钾<3.95 mmol/L时，rs1275988等位基因(Gvs.A)(χ2=4.474，P=0.034)、隐性模型(GG+GAvs.AA)(χ2=4.327，P=0.038)的分布在两组间差异有统计学意义，基因型(AAvs.GAvs.GG)(χ2=4.668，P=0.097)及显性模型(AA+GAvs.GA)(χ2=1.893，P=0.169)的分布在两组间差异无统计学意义；rs2586886等位基因(Gvs.A)(χ2=6.345，P=0.012)及显性模型(AA+GAvs.GA)(χ2=4.431，P=0.035)的分布在两组间差异有统计学意义，基因型(AAvs.GA vs GG)(χ2=5.298，P=0.071)及隐性模型(GG+GAvs.AA)(χ2=3.796，P=0.051)的分布在两组间差异无统计学意义。当血钾≥3.95 mmol/L时，rs1275988和rs2586886两个位点基因型(AAvs.GAvs.GG)(χ2=0.022，P=0.989；χ2=1.976，P=0.372)、等位基因(Gvs.A)(χ2=0.002，P=0.961；χ2=0.518，P=0.472)、隐性模型(GG+GAvs.AA)(χ2=0.018，P=0.893；χ2=0.200，P=0.655)及显性模型(AA+GAvs.GA)(χ2=0.000，P=0.991；χ2=1.301，P=0.254)的分布在两组间差异无统计学意义(表3)。

OSA相关基因型危险因素的Logistic回归分析分别对血钾<3.95 mmol/L和血钾≥3.95 mmol/L的人群进行Logistic回归分析，简单和校正混杂因素(如性别、吸烟、饮酒和BMI)后的多因素Logistic回归分析结果显示，在血钾<3.95 mmol/L的人群中，rs1275988和rs2586886两位点GG基因型是重度OSA患者的危险因素(OR=7.854，95%CI：1.710～36.000，P=0.008和OR=8.849，95%CI：1.816～43.117，P=0.007)；rs1275988和rs2586886位点G等位基因是OSA的危险因素(OR：GG>GA>AA)(表4)。

表2 TASK- 1基因多态性不同模型在非OSA组及重度OSA组分布频率的比较Table 2 Genotype and allele distributions in patients with severe OSA and non-OSA individuals

FDR：假阳性率
FDR：False discovery rate

表3 TASK- 1基因多态性不同模型在血钾分层中非OSA组及重度OSA组分布频率的比较[ n(%)]Table 3 Comparison of distribution frequencies of TASK- 1 gene polymorphisms in non-OSA and severe OSA groups in potassium stratification[ n(%)]

表4 血钾<3.95 mmol/L人群中OSA相关危险因素的Logistic回归分析Table 4 Logistic regression analysis for the genotypes related risk factors with obstructive sleep apnea in pokalemia<3.95 mmol/L

讨 论

TASK- 1是双孔K+通道家族的重要成员，广泛表达于呼吸中枢和外周组织，对缺氧和细胞外液pH变化极为敏感。OSA的主要临床表现为低氧血症和高碳酸血症，TASK- 1基因多态性可能与OSA有相关性，本研究选择TASK- 1基因中的两个候选SNPs(rs1275988和rs2586886)，对非OSA和重度OSA患者的基因型分布进行测定，通过评估人TASK- 1基因与OSA的关系，探讨了OSA的发病机制。

研究发现TASK- 1在大鼠呼吸中枢表达量增加可能参与了OSA发生，间歇性缺氧伴高碳酸血症可上调TASK- 1表达[4- 5]。TASK通道表达有助于中缝血清神经元的pH敏感性，导致与高碳酸血症和(或)酸中毒有关的呼吸和觉醒反射[17]。由于OSA与TASK- 1相似的生理机制，本研究进一步分析了人群中 TASK- 1基因多态性不同模型在非OSA组及重度OSA组分布频率的比较，结果显示，rs1275988和rs2586886两个位点基因型、等位基因、隐性模型及显性模型的分布在两组间差异无统计学意义，但这两个位点在重度OSA组中，GG基因型和G等位基因频率分布明显高于非OSA组，推测原因可能为OSA是一种多基因遗传病，受多种危险因素的影响，TASK- 1基因多态性对OSA仅产生了微效作用，这些危险因素可能削弱了基因多态性的微效应。

Jiang等[18]通过比较OSA和持续正压通气治疗后白细胞钾通道的mRNA表达，发现大多数钾通道的mRNA表达与OSA的严重程度和低氧血症呈负相关。我们根据既往研究及K+的生理作用，推测K+在OSA的发生发展中可能发挥一定作用，因此，本研究对血钾进行分层分析，由于血钾为非正态分布，故选取血钾中位数分为血钾<3.95 mmol/L组和血钾≥3.95 mmol/L组，结果表明GG基因型在血钾<3.95 mmol/L的OSA患者中频率更高。多因素Logistic回归分析结果显示，当血钾<3.95 mmol/L时，TASK- 1两个基因位点GG基因型是OSA患者的危险因素。可见，对于携带TASK- 1 GG基因型的患者，血清钾维持在3.95 mmol/L以上有利于减少OSA的发生。

由于细胞膜上钾的浓度梯度是细胞膜电位的关键决定因素，所以即使血清钾与正常值相差很小，也可能导致严重的肌肉功能障碍，引发呼吸衰竭和心脏停搏。膳食摄取钾可以降低血压，并降低心血管发病率、总死亡率和肾脏疾病进展的风险[19]，还可以提高睡眠效率和睡眠碎片[13]。因此，目前的指南建议饮食中钾的摄取量为90～120 mmol/d[20]，远高于世界人口日常的摄取量。当血钾低于4 mEq/L(mEq/L与mmol/L等价)，甚至在3.5～3.9 mEq/L范围内，与慢性肾脏病和充血性心力衰竭人群中的死亡率增加有关[21]。另外两项研究还发现，血清钾与慢性肾脏病患者的死亡率呈U形相关，与血清钾低于4 mEq/L患者的死亡率、心血管事件和终末期肾病增加有关[22- 23]。本研究分层分析发现，血清钾低于3.95 mmol/L时，会增加携带TASK- 1 GG基因型人群OSA的发生。本研究的切点值与目前指南建议血钾的维持水平相近，也是从临床表型去尝试探讨两者的相关性。

本研究存在以下局限性：(1)由于睡眠时缺乏动脉血气分析，不能评估低氧血症和高碳酸血症的程度；但是动脉血pH值受多种因素影响，白天低氧血症和高碳酸血症可自行纠正，故不能反映夜间低氧和高碳酸血症的程度。(2)本研究不是一个大规模研究，但病例组选择极端病例的方法去讨论基因多态性与疾病的相关性，意在放大该基因多态性在疾病中的效应，该结论不能推广到轻中度的人群中，还需在中度及轻度OSA人群中进一步验证。

综上，本研究结果发现，在血钾<3.95 mmol/L的人群中，TASK- 1基因，rs1275988和rs2586886两位点的GG基因型可能是发生重度OSA的潜在危险因素。对于携带TASK- 1 GG基因型的患者，血清钾维持在3.95 mmol/L以上有利于减少重度OSA的发生。rs1275988和rs2586886与OSA相关的机制尚不清楚。因此，TASK- 1 GG基因型在OSA中的确切机制和贡献有待进一步研究。