肺癌肿瘤干细胞的分选及生物学特性

张泽峰，高 峰，王 涛，王 瑞，郭 杨，张国亮，曾 辉，刘长江

河北医科大学第四医院胸外科，石家庄 050000

人类的器官和组织是由细胞组成，这些细胞通过进化保持功能和完整性，不同器官和年龄的细胞具有不同的迁移率、周转时间、增殖潜能和衰老前的寿命等特征。组织干细胞和转化扩增细胞的效力随组织类型和年龄不同而不同。在所有组织间室中，转化随时都可能发生，但转化细胞启动和维持病理肿瘤生长的能力需要一定的动力学特性，包括寿命、迁移潜能、自我更新和分化能力[1]。这些特性可与生理干细胞相媲美，具有这些特性的癌细胞被称为癌症干细胞，其在肿瘤细胞群中比例约为1‰[2]。故而，将肿瘤干细胞从肿瘤细胞群内分离具有一定难度，目前国内外采取的分选方式主要有荧光激活细胞和免疫磁珠分选两种。以分选后的细胞为研究对象进行移植瘤实验，能够通过对其体内成瘤活性的观察，判断干细胞特性存在与否。由于肿瘤干细胞特异的细胞表面标志不多，且在不同肿瘤组织中存在较大差异，因此当前对肿瘤干细胞的研究仍面临较大问题。ATP结合盒超级家族G2 [ATP-binding cassette super family G(White) member 2，ABCG2]、B细胞特异的莫洛尼白血病毒插入位点1(B cell specific Moloney leukemic virus insertion site 1，BMI- 1)、CD133目前是分选肺癌肿瘤干细胞的细胞标志物，其中，ABCG2蛋白为ABC超家族成员，属于P-糖蛋白。SP表型是肿瘤干细胞的特性，该特性的形成与ABCG2蛋白关系密切，故ABCG2蛋白对肿瘤干细胞分选有关键作用[3]。以往在类似细胞相互作用模型中的分析表明，二维细胞自动机定性模拟三维肿瘤生长动力学，提出的结果假设突变率为50%；其他突变率在不同时间尺度上产生定性相似的结果，较小的突变率产生生长较慢的肿瘤。突变体表型启动了一个过程，在每一轮连续的DNA复制中，增加整个基因组的突变数量。肿瘤的进化由基因不稳定驱动，是在随机诱变增加和克隆选择紧密耦合的条件下进行的。侧群(side population，SP)细胞分选法具有可以分离未知表面标志物的肺癌肿瘤干细胞等特点。肺癌肿瘤干细胞的鉴定实验包括体外实验和动物致瘤力实验。不同肺癌细胞类型的肺癌肿瘤干细胞标记物不同，其中肺癌干细胞的标记物主要包括OCT- 4、CD117及CD133等[4]，目前关于肿瘤中致瘤亚群比例的讨论仍很激烈。故而，本研究基于ABCG2蛋白探究肺癌肿瘤干细胞的分选及生物学特性的新方法，以期提高肿瘤干细胞的准确性和分选效率。

材料和方法

SPC-A- 1人肺腺癌细胞的培养和诱导将SPC-A- 1人肺腺癌细胞株(武汉博士德公司)接种于RPMI- 1640培养基(含 10%新生牛血清)中，置于37.0℃、5%CO2培养箱内，定期更换培养液，当细胞贴壁面积达到约80%时，采用0.25%浓度的胰蛋白酶溶液消化传代进行培养。以不同浓度的盐酸阿霉素(adriamycin，ADM)诱导 SPC-A- 1 细胞，诱导产生耐药性细胞株 SPC-A- 1/ADM。

ABCG2+细胞的观察通过倒置荧光显微镜对ABCG2+细胞是否存活于SPC-A- 1/ADM和SPC-A- 1细胞中进行观察。具体为：选择对数生长期的SPC-A- 1 和 SPC-A- 1/ADM 细胞，去除培养液后以PBS冲洗2次，添加0.5 ml 0.1 mol/L PBS和Mouse Anti-HumanABCG2/BCRP-FITC 25 μl混合均匀后，在37.0℃、5%CO2条件下，培养箱中培育30 min，去除培养液后用PBS溶液冲洗2次，荧光显微镜的激发波长和收集波长分别设置为488和630 nm，观察细胞染色情况并记录。

ABCG2+细胞的分选选择对数生长期SPC-A- 1/ADM细胞，以0.25%胰蛋白酶溶液进行消化，1000 r/min(r=15 cm)离心并收集细胞，用PBS溶液配成浓度为 1×107/ml的单细胞悬液，吸取0.5 ml置于分选柱内。将50 μl Bloking-AntibodyAnti-Human CD32(Fcy RII)加入单细胞悬液内，轻轻吹打混匀，加入25 μl Anti-HumanABCG2/BCRP-FITC，15 min后添加50 μl FITC Selection Cocktail，室温下静置15 min，加入25 μl Magnetic Nanoparticles Positive Selection后静置10 min。随后置于分选柱内继续补充推荐液至 2.5 ml，混匀充分后置于磁珠分选器内处理 5 min，将柱内液体翻转倒出，留下1滴，倒出含有 ABCG2-细胞的液体，收集并计数，以上操作重复3次，以平均计为A群细胞。将分选柱从磁场中取出后加入0.1 mol/L PBS 溶液洗脱管壁细胞，将含ABCG2+的细胞液体收集并记录，计作B群细胞。

ABCG2+细胞荧光显微镜的再观察将上述得到的群细胞均配制成单细胞悬液，浓度为1×107个/ml，分别吸取 100 μl加入20 μl ABCG2/BCRP-FITC，于 37℃、5%CO2培养箱中培养30 min，采用PBS 溶液冲洗2次，将细胞平板于荧光显微镜下倒置，激发波长、收集波长分别设置为488和630 nm，观察并记录细胞染色情况。

流式细胞分析建立 SPC-A- 1细胞组、SPC-A- 1细胞同型组、SPC-A- 1细胞ABCG2/BCRP-FITC处理组、SPC-A- 1/ADM细胞对照组、SPC-A- 1/ADM细胞同型组、SPC-A- 1/ADM细胞ABCG2/BCRP-FITC处理组、A群细胞处理组和B 群细胞处理组，每组重复3个平行实验。各组细胞浓度为 1×106个/ml，将各组按规定处理后进行流式细胞仪检测并记录结果。

SP细胞在裸鼠体内成瘤率的测定将裸鼠分别分成 A、B 两组(16只/组)：在 A 组裸鼠的左腋下接种SPC-A- 1 细胞(1×104个/位点)，右腋下接种A 群细胞(1×104个/位点)；在B组裸鼠的右腋下接种B 群细胞(1×104个/位点)。两组裸鼠均于恒温、恒湿、SPF的室内饲养。饲养裸鼠至肉眼可见瘤体(1周)，测量瘤体大小(长径、短径，连续2周，2～3 d 1次)。8周后取出成瘤组织，用10%福尔马林固定，石蜡切片后HE染色、封固、观察、成像。体内实验应采用SPC-A- 1/ADM细胞作为A、B细胞群的对照。成瘤率百分比=成瘤小鼠数量/小鼠总数量×100%。

统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以百分率(%)表示，组间比较采用χ2检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

ABCG2+细胞的荧光显微镜观察结果在10个视野范围，仅在1个视野内观察到少量被ABCG2/BCRP-FITC 标记的SPC-A- 1 细胞，且荧光强度低，激发光照射7 s后，可见少量的ABCG2+细胞。被ABCG2/BCRP-FITC标记的SPC-A- 1/ADM细胞明显可见，且在激发光照射7 s后，ABCG2+细胞亦清晰可见(图 1)。SPC-A- 1细胞中的荧光强度平均为(1.001±0.014)×102，明显低于SPC-A- 1/ADM细胞的(10.257±0.023)×102(t=17.320，P=0.001)。

ABCG2+细胞的分选结果在1×107个SPC-A- 1/ADM 细胞中能够分离出5×104个ABCG2+细胞，其比率为0.5%。

SPC-A- 1、SPC-A- 1/ADM、A 群和 B 群细胞的流式细胞分析结果SPC-A- 1细胞组、SPC-A- 1细胞同型组、SPC-A- 1细胞ABCG2/BCRP-FITC处理组、PC-A- 1/ADM细胞组、SPC-A- 1/ADM细胞同型组、SPC-A- 1/ADM细胞ABCG2/BCRP-FITC处理组、A群细胞ABCG2/BCRP-FITC处理组和B 群细胞 ABCG2/BCRP-FITC处理组的阳性率分别为(0.046±0.002)%、(0.088±0.005)%、(0.246±0.004)%、(0.042±0.001)%、(0.090±0.001)%、(9.801±0.122)%、(0.125±0.023)%和(84.512±4.042)%，差异有统计学意义(F=82.312，P=0.000)。其中，SPC-A- 1细胞ABCG2/BCRP-FITC处理组与SPC-A- 1细胞对照组(t=5.269，P=0.021)和SPC-A- 1细胞同型对照组(t=6.869，P=0.012)间差异有统计学意义；SPC-A- 1/ADM细胞对照组与SPC-A- 1/ADM细胞同型对照组间差异有统计学意义(t=8.112，P=0.015)。SPC-A- 1/ADM 细胞 ABCG2/BCRP-FITC 处理组阳性率为9.8%，是SPC-A- 1细胞组的39.84倍。SPC-A- 1/ADM细胞 ABCG2/BCRP-FITC 处理组与SPC-A- 1/ADM细胞组(t=9.120，P=0.005)和SPC-A- 1/ADM细胞同型组(t=8.257，P=0.006)间差异有统计学意义。B 群细胞阳性率是 A 群细胞的 684 倍，差异有统计学意义(t=11.235，P=0.001)，且 B 群细胞的荧光强度较强。

A.SPC-A- 1；B.SPC-A- 1/ADM
图1ABCG2+细胞的荧光显微镜观察结果(×300)
Fig1Fluorescence microscopy of ABCG2+cells(×300)

A群和B 群人肺腺癌细胞的裸鼠体内成瘤能力接种SPC-A- 1 细胞、A群细胞和B 群细胞的裸鼠平均成瘤体积分别为(6.96±1.82)、(6.70±2.55)和(9.17±2.41)mm3，以接种B群细胞组最高，但3组间差异无统计学意义(F=2.362，P=0.086)。接种B群细胞组的成瘤率为75.00%，明显高于接种SPC-A- 1 细胞组的6.25%和接种A 群细胞组的6.25%(F=19.780，P=0.002)。

B群细胞在裸鼠体内移植瘤的组织学观察在接种SPC-A- 1细胞和A 群细胞的裸鼠体内均未出现成瘤现象。接种B群细胞的裸鼠共出现12只裸鼠成瘤(图2)。

讨 论

肿瘤干细胞不仅存在于白血病中，还可能存在于其他癌症，如肾癌、乳腺癌、肺癌以及脑肿瘤等实体瘤内[5- 7]。基于agent的模型非常适合模拟单个细胞动力学，并评估肿瘤进展对单个细胞动力学的依赖关系[8-9]。有研究已经确定了一组正交的细胞动力学，包括细胞迁移率、增殖潜能、自发性细胞死亡和对称的癌症干细胞分裂[10]。在癌症干细胞驱动的肿瘤中，增殖潜能和自发细胞死亡已被证明非单调地调节整体肿瘤进展，肿瘤在体内不断得到扩大，最终可能形成新的肿瘤[11- 12]。研究显示，ABCG2与肿瘤细胞的耐药性具有密切联系[13- 14]，例如造血系统中同时表达 ABCG2 和造血干细胞表面标志[15]。不同组织内的ABCG2+细胞在一般干细胞表面标志物的表达方面差异较为明显[16- 18]。本研究鉴定肿瘤干细胞主要包括体内与体外两种实验方式。体内实验研究结果显示，SPC-A- 1与A 群的裸鼠体内无成瘤，接种 B 群细胞的裸鼠成瘤率则高达75%。将B群细胞移植至裸鼠对成瘤组织形态进行HE染色结果表明，移植瘤组织中出现表面光滑呈团块状且与周围组织的界限清晰等现象。说明与其他细胞比较，肿瘤干细胞在小鼠体内的致瘤性较强，较少细胞即可致瘤。

A.接种SPC-A- 1 细胞裸鼠，未出现瘤组织；B.接种A群细胞裸鼠，未出现瘤组织；C.接种B群细胞裸鼠，移植瘤组织质中出现表面光滑呈团块状且与周围组织的界限清晰，病理学检测切片中可见瘤细胞深染、核大、排列紧密且间质极少
A.nude mice inoculated with SPC-A- 1 cells：no tumor tissue was visible；B.nude mice inoculated with group A cells：no tumor tissue was visible；C.inoculated with group B cells in nude mice：the surface of transplanted tumor tissue was smooth and lumpy with clear boundaries with surrounding tissues，and the tumor cells were dark stained，large nucleus，closely arranged，and rarely interstitial in pathological sections
图2移植瘤组织HE染色观察结果(×300)
Fig2HE staining of transplanted tumor tissues(×300)

本研究采用免疫磁珠分选的方法对肿瘤干细胞进行分选，并通过移植瘤组织与裸鼠体内的实验对其特性进行分析，结果发现采用免疫荧光磁珠分离出的B群细胞内ABCG2+细胞比例显著升高。细胞增殖潜能是肿瘤生长的最强调节剂。早期增殖潜能的增加可产生与肿瘤干细胞竞争的更大数量的肿瘤细胞，从而抑制肿瘤干细胞的分裂。相反，增殖潜能的降低会降低瘤内竞争，并加速肿瘤干细胞池的扩展和进一步进化。有趣的是，在恶性肿瘤人群中确实观察到具有有限增殖能力的短寿癌细胞的短端粒，这进一步支持了限制肿瘤细胞后代数量可以促进亲代肿瘤干细胞的扩展和肿瘤的生长。细胞迁移和对称肿瘤干细胞分裂的增加总是导致肿瘤生长加快。虽然参数进化主要产生快速生长的肿瘤，但早期不利的突变事件可能最终将肿瘤动力学推向矮化的肿瘤生长或长期休眠，最终主导肿瘤的表型发展相对较晚，表明尽管之前观察到生长相对较快的，但所选择的初始参数值对肿瘤的进展并不理想。成功进化的肿瘤表现出表型的异质性分布，不同的亚克隆控制着局部的扩增。这证实了瘤内异质性和分支进化的临床观察，这些分支进化具有空间上不同的遗传特征肿瘤化疗中的主要难点之一即为耐药。本研究表明在ADM诱导后耐药性细胞中ABCG2+细胞数量增加，本研究结果为通过免疫磁珠分选ABCG2+细胞提供了理论条件的研究依据。经免疫磁珠分选法后，A群细胞中的ABCG2+数量比SPC-A- 1/ADM 细胞下降；而B 群细胞中 ABCG2+细胞数量增加。这是因为，在肿瘤干细胞内，ABCG2细胞主要借助于NBD与TMD区发挥化疗药物的外排功能，NBD的作用主要为对ATP水解时的能量释放进行接受，进而使ABCG2充当药物流出泵的作用对细胞内的化疗药物进行运载。TMD区主要包含6个跨膜螺旋结构，作用为提供化疗药物或底物的结合位点，通过对自身结构进行改变从而完成药物由细胞质向细胞膜的转移。此外，ABCG2不仅能够在细胞膜对特异性抗肿瘤药物进行特异性运转，还可对细胞内部分化疗药物的活性以及其代谢成分产生一定影响。

本研究表明，对于肺癌内肿瘤干细胞的准确鉴定应该还是需要基于多个细胞表型的交叉分析才能获得，对于肺癌中肿瘤干细胞的鉴定，无论对于细胞系还是肿瘤组织都具有重要意义，只有这样才能确定肿瘤干细胞的表型并且探究清楚肿瘤干细胞在整个肿瘤的生长转移再发中所起的作用，以找到更加明确的抗肿瘤治疗靶点，该观点与彭卓等[19]的研究一致。

综上，本研究结果显示，ABCG2抗体结合免疫磁珠分选法能够分离人肺腺癌 SPC-A- 1/ADM细胞株中的 ABCG2+细胞，并通过对其在裸鼠体内成瘤率探讨肺癌肿瘤干细胞的分选及其生物学特性。