丹酚酸B对肠缺血再灌注损伤大鼠模型肠道的保护作用

陈桂林，徐 姗，吴紫娟，吴 祎

江苏常州市第二人民医院药剂科，江苏常州 213000

肠缺血/再灌注是由急性肠系膜缺血、严重感染、创伤性休克和手术过程引起的病理生理过程[1- 2]，其发展可导致多器官功能障碍和全身炎症反应综合征，是外科患者发病和死亡的重要原因[3- 4]。虽然在再灌注过程中恢复血流和再充氧对其拯救至关重要，但它会引发一系列事件，可能导致额外的细胞损伤，称肠缺血再灌注损伤(intestinal ischemia reperfusion injury，IIRI)，而且常超出最初的缺血损伤。过度损伤是多种因素造成的，包括炎症细胞因子释放[5]、氧自由基形成[6]、损伤组织中性粒细胞浸润[7]。肠缺血/再灌注可增加肠道通透性，破坏黏膜屏障功能[8- 9]。受损的肠黏膜屏障可能导致肠上皮通透性增加，因此逆转肠上皮通透性的增加对肠缺血/再灌注的保护和改善具有重要意义。丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)为唇形科植物丹参的根及根茎提取而得，由3分子丹参素与1分子咖啡酸缩合而成，具有活血化瘀、通经活络之功效，本研究评估了SAB对肠缺血/再灌注大鼠模型肠道的保护性效应。

材料和方法

材料24周龄健康雄性SD大鼠48只，体质量225～275 g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK-(军)2012- 0004；饲养于常州市第二人民医院实验中心屏障系统动物房，在12 h光/暗循环控制条件下进行，温度(25±3)℃，相对湿度55%～60%。组织匀浆机(无锡沃信仪器制造有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性测定试剂盒、白细胞介素interleukin(IL)- 1β ELISA试剂盒和HE染色试剂盒(上海碧云天公司)，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)RT-PCR试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)RT-PCR试剂盒、IL- 1β RT-PCR试剂盒、IL- 6 RT-PCR试剂盒、Trizol试剂、NF-κB ELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒和IL- 6 ELISA试剂盒[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]。

IIRI大鼠模型的建立及分组SD大鼠禁食12 h，在实验前一晚可自由饮水。肌肉注射氯胺酮(90 mg/kg)麻醉动物，成功后腹腔镜中线开腹寻找肠系膜上动脉，采用无损伤动脉夹将肠系膜上动脉夹闭60 min，闭塞血管环达到阻断内脏循环的目的，然后将动脉夹除去，使肠系膜上动脉恢复，再灌注4 h。阻断成功标志是远端肠系膜血管搏动消失且肠壁颜色渐苍白。再灌注成功的标志是远端肠系膜血管搏动恢复，肠管颜色由苍白转变为粉红。在手术干预之间，缝合中间切口，并用保鲜膜覆盖，以减少液体损失。保持一个适当的麻醉平面，在手术过程中将大鼠放在恒温37°C的加热垫上。再灌注后，收集整个小肠。本研究经江苏常州市第二人民医院实验动物伦理委员会审核。

采用随机数字表法将48只大鼠随机分为以下4组(n=12)：(1)IIRI组：手术寻找肠系膜上动脉，阻隔血流60 min后解除，再灌注4 h；(2)SAB+IIRI组：术前先采用SAB以40 mg/kg经腹腔注射预处理1周后，同IIRI组手术操作；(3)阴性对照组：经开腹手术但不结扎肠系膜上动脉；(4)SAB+阴性对照组：术前先采用SAB以40 mg/kg经腹腔注射预处理1周后，经开腹手术但不结扎肠系膜上动脉。

标本制备模型建立成功24 h后，将所有大鼠经腹腔注射麻醉后，从尾静脉取得血液样本，收集于肝素抗凝管中以分离血浆。于大鼠回肠处切取部分回肠肠管(5 cm左右)，一部分以10%多聚甲醛固定以行组织病理学分析，一部分留存为做肠道通透性检验的样本，剩余部分加入PBS进行制备组织液匀浆。

MDA含量测定按照MDA含量测定试剂盒说明书进行测定，具体为：将回肠组织匀浆在4℃条件下3 000 r/min(r=15 cm)离心10 min，转移上清液至1.5 ml离心管中；实验设置标准孔、空白孔、对照孔、测定孔，其混合体系如表1所示(剂量体积均为1 ml)。将上述混合体系充分混匀，95℃孵育40 min后流水冷却，4000 r/min(r=15 cm)离心20 min，在532 nm条件下测定其上清液的OD值。MDA含量计算公式：MDA 含量(nmol/ml)=[(测定孔OD值-对照孔OD值)/(标准孔OD值-空白孔OD值)] ×标准品浓度(1×105μmol/L)×稀释倍数。

表1 MDA含量测定的试剂混合体系Table 1 Reagent mixture system for MDA content determination

MDA：丙二醛
MDA：malondialdehyde

SOD活性测定SOD活性按照试剂盒说明书进行测定，其混合体系如表2所示，具体为：充分混匀后，37℃水浴40 min，各加入2 ml显色剂进行混合，室温静置10 min，550 nm条件下使用蒸馏水调零，测得各孔OD值。计算公式如下：SOD活性(U/ml)=[(对照孔OD值-测定孔OD值)/对照孔OD值]/50%×反应体系稀释倍数(3.33/0.03)×样本测定前稀释倍数。

RT-PCR法检测炎症因子转录水平采用Trizol试剂提取各组大鼠回肠组织RNA，按照反转录试剂盒说明书操作合成cDNA，经过RT-PCR反应体系，以β-actin为内参，分别对各组实验大鼠回肠组织匀浆中相关炎症因子NF-κB、TNF-α、IL- 1β、IL- 6的相对表情况进行测定。利用NCBI软件进行引物设计，引物设计结果如表3所示。

表2 SOD活性测定的试剂混合体系Table 2 Reagent mixture system for SOD activity determination

SOD：超氧化物歧化酶
SOD：superoxide dismutase

表3 引物设计结果Table 3 Primer design

NF-κB：核因子κB；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL：白细胞介素
NF-κB：nuclear factor kappa-B；TNF-α：tumor necrosis factor alpha-α；IL：interleukin

ELISA法检测炎症因子的分泌水平标准品稀释、加样，用封板膜封板后置37℃温育30 min，将30倍(48T的20倍)浓缩洗涤液用蒸馏水30倍(48T的20倍)稀释后备用，洗涤，每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外，温育，洗涤，每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min，终止反应，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

肠道组织学检测将肠组织剩余部分固定在10%缓冲多聚甲醛中1周，石蜡包埋，HE切割染色，3名独立调查员盲法进行组织学评估，取平均评分进行分析。损伤采用半定量分级方案进行分类，根据黏膜损伤类型和黏膜下损伤类型，对各部位进行数值评分。

统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，计量资料的方差齐性检验采用单因素方差分析，等级资料采用多个独立样本非参数检验进行总体比较，组间比较采用两独立样本非参数检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

MDA含量检测结果阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的MDA含量分别为(1.35±0.11)、(2.63±0.18)、(1.89±0.21)和(1.44±0.15)nmols/mg，差异有统计学意义(F=15.865，P=0.002)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.005)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.012)。

SOD活性检测结果阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的SOD活性分别为(6.13±1.22)、(4.89±0.14)、(5.62±0.67)和(5.99±0.72)U/mg蛋白，差异有统计学意义(F=12.126，P=0.006)；其中，IIRI组低于阴性对照组(P=0.006)，SAB+IIRI组高于IIRI组(P=0.017)。

回肠内炎症因子转录水平

TNF-α：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的光密度分别为83.41±7.21、158.21±11.57、134.33±10.20和84.76±9.14(P=0.001)，差异有统计学意义(F=25.127，P=0.001)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.003)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.009)(图1)。

IL- 1β：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的光密度分别为43.21±6.89、80.04±12.15、57.42±9.01和46.91±7.95，差异有统计学意义(F= 28.269，P=0.001)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.026)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.005)(图1)。

IL- 6：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的光密度分别为51.12±3.60、90.69±9.87、63.94±12.13和49.38±11.32，差异有统计学意义(F=14.362，P=0.007)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.015)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.003)(图1)。

NF-κB：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的光密度分别为67.25±6.19、140.43±12.33、88.47±9.25和71.08±11.27，差异有统计学意义(F= 20.428，P=0.002)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.007)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.015)(图1)。

IL：白细胞介素；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；NF-κB：核因子κB
IL：interleukin；TNF-α：tumor necrosis factor alpha-α；NF-κB：nuclear factor kappa-B
图1RT-PCR法检测各组大鼠回肠内炎症因子转录水平
Fig1RT-PCR of inflammatory factor transcription levels in the ileum of rats in each group

回肠内炎症因子分泌水平

TNF-α：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的TNF-α水平分别为(125.75±14.25)、(158.21±11.67)、(185.96±15.29)和(195.36±15.24)μg/ml，差异有统计学意义(F=30.256，P=0.002)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.002)，SAB+IIRI组高于IIRI组(P=0.006)。

IL- 1β：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的IL- 1β水平分别为(59.68±9.85)、(120.25±19.68)、(78.96±14.21)和(75.96±12.26)μg/ml，差异有统计学意义(F=30.217，P=0.002)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.002)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.006)。

IL- 6：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的IL- 6水平分别为(85.96±9.68)、(125.56±15.26)、(89.62±25.27)和(59.82±25.63)，差异有统计学意义(F=18.652，P=0.001)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.008)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.002)。

NF-κB：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的NF-κB水平分别为(99.59±12.52)、(185.26±25.98)、(125.20.47±12.58)和(101.25± 15.95)μg/ml，差异有统计学意义(F=17.415，P=0.001)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.026)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.005)。

SAB预处理对各组大鼠小肠通透性功能的影响

菊粉：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的Papp分别为(12.66±1.21)、(12.03±1.57)、(10.56±1.20)和(13.02±1.11)cm/s，差异有统计学意义(F=9.985，P=0.021)；其中，IIRI组低于阴性对照组(P=0.015)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.011)。

右旋糖酐：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的Papp分别为(6.05±1.67)、(5.38±1.21)、(5.72±1.60)和(6.14±2.10)cm/s，差异有统计学意义(F=8.693，P=0.036)；其中，IIRI组低于阴性对照组(P=0.011)，SAB+IIRI组高于IIRI组(P=0.012)。

RPC：阴性对照组、IIRI组、SAB+IIRI组和SAB+阴性对照组的RPC水平分别为(2.09±0.21)、(2.23±0.18)、(1.84±0.19)和(2.12±0.22)，差异有统计学意义(F=8.420，P=0.041)；其中，IIRI组高于阴性对照组(P=0.031)，SAB+IIRI组低于IIRI组(P=0.020)。

回肠病理组织学变化结果阴性对照组大鼠回肠组织切片显示出正常的黏膜，Chiu组织学得分为(0.11±0.14)分；IIRI组大鼠回肠组织切片显示肠绒毛完全暴露，固有层存在大量中性粒细胞浸润和大量坏死，Chiu组织学得分为(3.65±0.42)分；SAB+IIRI组大鼠回肠组织切片显示肠黏膜发生小面积水肿、坏死及些许绒毛剥脱现象，Chiu组织学得分为(2.14±0.37)分；SAB+阴性对照组大鼠回肠组织切片结果显示为正常组织学形态，Chiu组织学得分为(0.09±0.11)分，明显高于阴性对照组(P=0.001)；SAB+IIRI组明显低于IIRI组(P=0.001)。

讨 论

IIRI是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克等情况下，以及肠梗阻、腹主动脉瘤手术、体外循环、小肠移植术等手术的病理生理过程中起重要作用。IIRI不仅可引起肠道局部损伤，且可因肠黏膜屏障被破坏而引起肠内细菌、内毒素向肠外组织和器官移位，从而导致全身炎性反应综合征、多脏器功能不全综合征和多脏器功能衰竭发生。

SAB是从丹参(丹参根)中分离得到的一种天然酚酸，为丹参中含量最丰富、生物活性最强的成分，也是一种广泛应用于各种心血管疾病、神经疾病和肝病治疗的中药[10]。李祥等[11]研究发现，SAB可激活PI3K/Akt信号通路，诱导NF-κB核因子相关因子Nrf2、血红素加氧酶1和谷氨酸-l-半胱氨酸连接酶催化亚基表达，通过Nrf2介导的作用保护对乙酰氨基酚诱导的肝损伤和多巴胺能神经元。多项研究显示，SAB具有减轻氧化应激、减轻炎症和疼痛、抑制细菌生长、调节屏障功能障碍等作用，在体内和体外均具有抗氧化活性[12- 14]。

本研究建立了IIRI模型，结果发现，IIRI组的右旋糖酐水平明显低于阴性对照组和SAB+IIRI组，葡聚糖凝胶水平明显高于阴性对照组和SAB+IIRI组；IIRI组的菊粉水平明显低于阴性对照组，高于SAB+IIRI组；SAB预处理能改善大鼠回肠组织肠黏膜的水肿、坏死和绒毛剥脱现象，SAB+阴性对照组的Chiu组织学得分明显高于阴性对照组，SAB+IIRI组Chiu组织学得分明显低于IIRI组；提示IIRI可以破坏肠黏膜屏障，SAB预处理对肠黏膜屏障具有保护作用。此外本研究还显示，IIRI组的MDA含量明显高于阴性对照组和SAB+IIRI组，SOD活性明显低于阴性对照组和SAB+IIRI组；IIRI组的TNF-α、IL- 1β、IL- 6和NF-κB的转录和分泌水平均明显高于阴性对照组和SAB+IIRI组，说明IIRI可诱发肠道的氧化应激和炎症反应水平，SAB预处理可改善两者反应。综上，本研究结果显示，SAB的预处理能够减轻IIRI，这种保护性效应可能是通过减轻肠道的氧化应激反应和炎症反应来实现。

图2大鼠回肠肠道组织学表现(HE，×300)
Fig2Histological findings of ileum in different groups(HE，×300)