抗C反应蛋白自体抗体在系统性红斑狼疮中的研究进展

李秋钰，于 峰

1北京大学第三医院呼吸与危重医学科，北京 100191 2北京大学第一医院肾脏内科，北京 100031

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多个系统的常见的自身免疫性疾病[1]，突出特点为大量自身抗体产生，然而与其他经典的自身免疫病如类风湿关节炎不同的是，系统性红斑狼疮中的C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)水平却往往正常，其具体的发病机制尚不清楚，目前考虑与基因背景或CRP自身抗体的存在有关。

CRP的生物学特性和病生理功能

CRP是1种有5个相对分子质量为23 000的相同亚基组成的血浆蛋白质，它们对称地分布在中心孔的周围[2]，该蛋白质在进化中高度保守，无氨基酸序列的突变，在远古时代的鲎体内即存在。作为典型的急性期血浆蛋白，因CRP血浆浓度在响应炎症反应时能够从基线低浓度(<1 μg/ml)迅速增加到超过1000倍，长时间以来其一直作为临床上炎症反应的非特异性标志物。CRP作为一个模式识别的分子，能够与细胞坏死过程中所暴露的或者病原菌表面的一些特殊的分子构型结合，在组织损伤或者感染后的数小时里可以快速合成，这暗示其参与了宿主防御，是先天免疫应答的一分子。

CRP存在五聚体CRP(pentameric CRP，pCRP)和单体CRP(monomeric CRP，mCRP)两种天然异构体形式。pCRP可以在无钙、高浓度的脲、低pH、触及受损的细胞膜等情况下不可逆地变构成单体的mCRP。mCRP主要以组织结合形式存在，是存在于血管内膜的天然组分[3]，对于血管的平衡具有特定调节功能，在内皮细胞、平滑肌细胞以及ApoE-/-小鼠斑块组织周围的胞外基质中均有表达[4]，而pCRP则是一种血浆蛋白质[5]。CRP通过五聚体解聚可以形成mCRP，在这个过程中蛋白质的二级结构β折叠减少而α螺旋结构增加，并且位于蛋白质内部的残基暴露出来，特别是C端的199位至206位，该位点被认为是mCRP形成后的新生抗原表位[6]，使mCRP表现出与原五聚体蛋白不同的生物学特性[7-8]。同时mCRP上的35～47位被认为是mCRP与多种蛋白质结合位点。Wang等[9]研究发现，mCRP基础上还原其二硫键位点后能够形成一种更具生物学特性的异构体——还原态mCRP。CRP通过巯基的氧化还原更为巧妙地对结构和功能进行调控，当pCRP转变为mCRP后，位于五聚体内部的二硫键暴露，继而能进一步被体内小分子还原剂(如谷胱甘肽和半胱氨酸)以及炎症条件下分泌的硫氧还蛋白还原，增强了疏水性且释放了低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)结合位点，从而使蛋白发挥更为强烈的炎症反应(图1)。

CRP不仅是一种反映炎症水平的生物标志物，其本身在天然或固有免疫反应中还具有很多重要的生理保护功能(图2)，如其可以激活补体通路或通过Fcγ受体调理巨噬细胞的吞噬作用来协助清除细胞碎片及凋亡细胞等[10-12]。一方面，CRP固定于细胞表面后，可通过与补体C1q结合激活补体经典途径的早期补体成分，导致补体C3的活化，产生大量补体C3b；同时通过与补体H因子和补体C4结合蛋白的结合，抑制补体C3转化酶和补体C5转化酶的进一步活化产生膜攻击复合物，通过C3b与损伤细胞表面结合进行间接调理[13]；C3b可与靶细胞(或免疫复合物)及具有C3b受体的吞噬细胞结合起到桥梁作用，从而调理吞噬细胞的吞噬。另一方面，CRP在与细菌表面多糖及损伤细胞表面的磷酯胆碱(如晚期凋亡细胞)结合后，可以直接与吞噬细胞表面的高亲和力的FcγRI(CD64)及低亲和力的FcγRIIa(CD32)结合，从而发挥直接调理作用，调理吞噬细胞的吞噬来协助清除细菌、细胞碎片及凋亡细胞等[14]。

CRP：C-反应蛋白
CRP：C-reactive protein
图1五聚体CRP解聚为单体CRP示意图
Fig1Schematic diagram of the depolymerization of pentameric CRP to monomeric CRP

MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1；IL-8：白细胞介素-8；ICAM-1：胞间黏附因子-1；VCAM-1：血管细胞黏附因子-1
MCP-1：monocyte chemoattractant protein-1；IL-8：interleukin-8；ICAM-1：intercellular adhesion molecule-1；VCAM-1：vascular cell adhesion molecule-1
图2在内皮细胞、中性粒细胞、血小板实验及2种动物模型的体内实验中，mCRP 的抗炎/促炎作用表现为，大部分体外实验显示促炎活性而体内实验有抗炎活性
Fig2Invivoexperiments of endothelial cells，neutrophils，and platelets and two animal models demonstrated the anti-inflammatory/pro-inflammatory effects of mCRP，mostinvitroexperiments showed pro-inflammatory activity whileinvivoexperiments showed anti-inflammatory activity

目前研究证实补体系统功能异常是SLE及狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)的主要发病机制之一，其扮演的是“双刃剑”的角色：早期补体成分如C1q缺乏或功能低下即可导致SLE的发生，而补体系统过度激活同样也可以引起SLE患者脏器的免疫炎性损伤。在众多补体成分中，C1q分子是补体经典途径中最为重要的早期识别分子，在清除致病微生物和凋亡的细胞成分时发挥着极为重要的作用，而C1q在发挥识别分子的功能时需依赖CRP的调理功能，五聚体CRP与补体C1q结合后，可以激活补体的经典途径。除此之外，五聚体CRP与补体另一重要分子L-ficolin结合后，可以激活补体的凝集素途径，这些均是CRP参与清理细胞碎片的机制之一；CRP与补体C4结合蛋白结合后则可以抑制经典途径的激活，与补体旁路途径的调节蛋白H因子结合后，可以抑制补体旁路途径的C3和C5转化酶，从而抑制补体的过度活化，这也是五聚体CRP激活补体途径一般仅能进行至C1～C4这一步的原因所在[15]。

近来大量研究发现，与pCRP相比，mCRP具有更多独特的生物学效应，也是近年来国际上研究CRP功能的热点之一[16]：如它与C1q的结合能力更强，激活C1的能力更强，与补体调节蛋白结合的能力也较五聚体CRP有所增强等[17]。由此可见，CRP与补体系统的关系非常微妙和复杂，通过“激活”与“抑制”功能相互的完美制衡，得以保障人体免疫系统的稳定。

如上所述，CRP可以通过与核抗原、凋亡细胞、免疫复合物等结合，激活补体，或通过Fcγ受体调理巨噬细胞的吞噬作用来协助清除细胞碎片及凋亡细胞，从而减少自身抗原与免疫系统的接触，维持机体“免疫耐受”的状态，而减少自身抗体形成的可能。由于目前大多数学者认为患者“免疫耐受”机制的破坏造成多种自身抗体形成，并在各种脏器特别是肾脏沉积是SLE及LN发病的基本环节，结合CRP在SLE及LN患者血清中“反常”的平稳这一现象，我们推测CRP保护功能的受限可能参与了SLE及LN的发病，而目前的临床研究也提示了CRP本身确实可以抑制模型的发生与发展[18]。

抗CRP自体抗体在SLE发病机制中的作用

SLE患者中存在抗CRP抗体鉴于关于SLE患者中CRP浓度正常的原因一直不清，结合该病的特点为体内存在多种自身抗体，因此对于抗CRP抗体的研究得到了相关领域的关注。1985年，Robey等[19]首次在8例SLE患者中发现了2名患者CRP自身抗体的存在。从此国内外学者开始了CRP自体抗体的研究。抗mCRP抗体普遍存在于SLE患者中。目前，各家报道的抗mCRP抗体的阳性率在10%～78%间(表1)[19-30]。这主要与入组SLE患者的受累器官及疾病活动度不同，存在一定异质性，以及不同各实验室的检测方法存在差异有关。有实验室直接用单体mCRP进行铺板，有实验室利用五聚体pCRP进行铺板，因为不同的CRP异构体的抗原表位不同，因此检测的结果也应有所不同。

抗CRP抗体实际的抗原表位为mCRP1998年，Bell等[20]在一些患有自身免疫病的患者中发现了抗CRP抗体的靶抗原可能为mCRP。Sjöwall等[21]证实了抗CRP抗体仅与固定于表面的CRP抗原反应，而与溶液中的pCRP不结合。从SLE患者血清中提取的免疫复合物几乎不与包板CRP结合，进一步说明了患者识别的应该是mCRP。

抗mCRP自体抗体的水平与SLE患者临床活动度相关Sjöwall等[21]收集了10例SLE患者的系列血液样本，结果发现在复发时该抗体滴度可显著升高，且与抗ds-DNA抗体滴度呈正相关，与C1q、C3、C4和淋巴细胞计数的水平成反比。Figueredo等[31]也发现抗mCRP抗体阳性的患者不仅具有更高的C3水平，还更易出现抗ds-DNA抗体和抗心磷脂抗体。Kessel等[32]研究发现抗mCRP抗体阳性率在抗ds-DNA抗体阴性的SLE患者中高于阳性者(45%比33%)，但差异没有统计学意义。O’Neill等[33]研究结果显示，活动性SLE患者的抗mCRP抗体水平高于稳定的SLE患者，但差异也没有统计学意义。

进一步的研究还发现抗mCRP抗体与SLE患者肾脏受累具有相关性。Figueredo等[31]研究发现抗mCRP抗体阳性的SLE患者发生肾脏受累的比例较高。Sjöwall等[21]研究发现在肾脏受累的SLE患者疾病复发时，抗mCRP抗体均阳性。在后续研究中，Sjöwall等[21]对38例经肾活检诊断为LN的患者在随访超过6个月时进行了重复肾活检，并在两次肾活检前均进行了抗mCRP抗体的检测，根据英国狼疮评估小组量表(BILAG量表)评价了疾病活动度，并评价了肾脏病变急性病变指数(activity index，AI)和慢性病变指数(chronicity index，CI)。结果显示，抗mCRP抗体在随访期滴度下降，抗体水平与BILAG评分具有相关性。且抗mCRP抗体水平与AI有相关性，与CI无相关性；与抗ds-DNA抗体滴度呈正相关，与C3和C4水平成负相关。这些均提示抗mCRP自身抗体可能不仅仅是一种SLE的生物标记物，还与LN具有显著的相关性。

表1 抗mCRP自体抗体在SLE中的临床研究Table 1 Clinical studies on anti-mCRP autoantibody in SLE

mCRP：单体C反应蛋白；SLE：系统性红斑狼疮；LN：狼疮性肾炎
mCRP：monomeric CRP；SLE：systemic lupus erythematosus；LN：lupus nephritis

抗mCRP抗体与SLE治疗效果及预后相关mCRP抗体不仅与全身及局部肾脏活动性相关，在治疗反应及预后方面也有阳性发现。Sjöwall等[21]研究发现，抗mCRP抗体在预测肾脏不佳疗效方面优于抗ds-DNA抗体和抗C1q抗体。2015年Jeong等[34]研究结果显示：抗CRP抗体阳性SLE患者治疗失败的风险增加了1倍以上。即使治疗有效，抗mCRP抗体阳性患者的反应时间也要显著长于抗mCRP抗体的阴性患者。该发现提示抗CRP抗体除了可用于监测SLE疾病活动，还可以作为预测不良治疗反应的重要指标。由于SLE中的治疗反应可能存在滞后性，研究者还在2年的标准治疗后调查了治疗反应情况。与此同时，研究者还检测了整个随访期内(中位数5.9年)复发的频率。结果表明：经过2年的治疗之后，在维持治疗期间，基线抗CRP抗体阳性似乎是治疗反应的强预测因子。阳性患者面临的非反应风险比阴性患者高10倍以上。2年治疗后的治疗反应取决于第1年的反应。在第1年没有反应的患者更可能(概率高10倍以上)在延长的治疗期间不发生反应。已经提到的预测指标似乎是相互独立的并且每个都有附加效应。携带两种危险因素(在基线时抗CRP抗体阳性，在第1年没有反应)的患者在第2年的治疗失败风险大约比阴性患者高50倍。因此这一项强预测指标表明：对于这样的患者应考虑强化现有治疗或使用替代治疗方法(例如生物治疗)。

Tan等[35]研究发现，LN患者活动期血清IgG型抗mCRP抗体阳性率为59.4%，显著高于无临床肾损害的SLE患者(40.8%)。活动期抗mCRP抗体阳性患者缓解期抗体全部转阴。抗mCRP抗体阳性患者的SLE临床活动度评分显著高于抗体阴性者。抗mCRP抗体阳性患者较mCRP抗体阴性患者易出现急性肾衰竭、口腔溃疡和活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)延长。抗mCRP抗体阳性水平与间质炎症、肾小管萎缩、间质纤维化及慢性指数的半定量评分呈正相关。

Li等[29]比较了mCRP阳性和阴性两组患者的临床表现、实验室检查、病理评分，mCRP自体抗体的抗原表位，结果发现mCRP35-47及mCRP199-206是主要的抗原表位，并且mCRP35-47抗体阳性患者的肌酐清除率更低、肾脏病理AI及CI水平更高，提示肾脏损伤更严重，该抗体不仅有指示疾病损伤的意义，同时具有预测预后的价值，即mCRP35-47抗体阳性组的预后更差(即进入终末期肾脏病及肌酐翻倍更多)。进一步的生物学功能实验结果显示，这个肽段的自体抗体可以明显抑制补体旁路的调节因子H因子与mCRP的结合及H因子的功能，是个有功能的自体抗体。

抗mCRP自体抗体在SLE发病机制中的作用

Mathsson等[36]研究发现，抗mCRP抗体水平与SLE患者的补体激活相关。Yang等[37]研究显示，mCRP与C1q、C1q胶原区、C1q头状区的解离常数分别为0.52、15.7、133nM。当抗mCRP抗体达到5.27 g/ml时，可以抑制mCRP与C1q的结合；当抗mCRP抗体在高于4.45 g/ml 时，抗mCRP抗体可以抑制mCRP与H因子的结合。mCRP主要与C1q的胶原区相结合，其与H因子的结合呈剂量依赖性。mCRP抗体可以抑制mCRP与C1q及mCRP与H因子的结合。此外，mCRP在N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)的基础上可以促进巨噬细胞对晚期凋亡的吞噬，部分SLE患者的抗mCRP抗体可以抑制mCRP的这一作用，抑制SLE患者凋亡细胞的清除，参与SLE的发病过程。抗mCRP抗体抑制吞噬的可能机制是：(1)部分SLE患者的抗mCRP抗体可能通过抑制凋亡细胞表面mCRP与C1q的结合，抑制C3bi的生成，继而抑制巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬作用。(2)以往研究显示，mCRP可显著提高巨噬细胞吞噬凋亡细胞的能力，mCRP可能为SLE患者调节凋亡清除的重要分子。

抗mCRP自体抗体的异质性，有研究推测可能是SLE自身抗原的来源，即：早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、凋亡小体[37]。因此在SLE中，抗mCRP抗体是如何产生以及其如何参与疾病发病的具体机制尚不清楚。有学者推测，在炎症诱导的组织(如肾脏)处在酸化的微环境中时，pCRP可以分解为mCRP；同时，外周血淋巴细胞和局部组织细胞也可分泌mCRP，作为局部的抗原。而另一方面，在SLE中，循环CRP的缺乏可导致凋亡细胞逃逸网状内皮的吞噬，进一步导致大量的自身抗体产生，如抗核抗体等，其中抗mCRP抗体可以与沉积在脏器或局部分泌的mCRP相结合，形成原位免疫复合物，导致组织和器官损伤，如肾小球肾炎等。抗mCRP抗体还可以结合凋亡或受损细胞表面上的mCRP，影响mCRP的调节功能，抑制凋亡细胞和细胞碎片的去除；抗mCRP抗体也可以通过影响mCRP与补体结合的间接调节功能，在体内导致大量的凋亡细胞和细胞碎片积累，从而暴露更多的自身抗原，导致恶性循环。

因此我们认为，抗mCRP自体抗体可以抑制mCRP与C1q及mCRP与H因子的结合调节补体系统的激活，抑制SLE患者凋亡细胞的清除，参与SLE的发病过程。

展 望

鉴于目前国内外有关抗mCRP抗体在SLE，特别是LN中的研究大多属于观察性研究，均未深入涉及到该自身抗体的功能性研究。而无论是CRP、C1q，还是H因子，均存在众多配体，抗mCRP抗体虽然能抑制mCRP与C1q、H因子的结合，但其对于补体系统激活的程度、清除凋亡细胞的调理功能等方面影响尚不明确，其具体机制值得需进一步研究。