辛伐他汀对糖尿病大鼠神经病理性疼痛和全身性炎症的影响及其分子机制

张 欣，申 乐，黄宇光

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京 100730

神经病理性疼痛是一种躯体感觉神经系统损伤或者疾病引起的疼痛。糖尿病、带状疱疹病毒、肿瘤和获得性免疫缺陷综合征等都可以导致外周神经发生损伤，当损伤持续存在较长时间后，就会产生痛觉异常或者痛觉过敏的现象。中国成年人的糖尿病患病率为10.4%[1]，病程较长的患者容易发生糖尿病神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain，DNP)，给患者和社会带来了沉重的经济负担。他汀类药物是一种选择性的3-羟基- 3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxy- 3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂，主要用于高胆固醇血症及心血管疾病的治疗。大量研究显示，他汀类药物除了传统的降低胆固醇的作用之外，还具有抗炎[2- 3]、抗氧化[4]、神经保护[5]和钙离子通道调节[6]等生物学作用。近来研究人员在脊神经结扎(spinal nerve ligation，SNL)、坐骨神经压伤和慢性压迫性损伤(chronic constrictive injury，CCI)动物模型中[7- 9]发现，他汀类药物能够在一定程度上缓解神经病理性疼痛的症状。

研究显示，晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)通路在糖尿病肌病[10]、巨噬细胞浸润[11]和糖尿病肾损伤[12]的病理生理过程中发挥重要作用，脊髓中RAGE的上调和激活参与了bortezomib导致的疼痛中枢敏化[13]。Liu等[14]研究发现，大鼠脊髓背角AKT的磷酸化水平在CCI模型中显著升高。多项研究显示，RAGE的高表达和AKT的磷酸化与疼痛的发生发展密切相关[15- 18]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)主要由细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38 蛋白和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)组成，MAPKs在脊髓中的激活是DNP发生和维持的重要机制之一[19]，也是DNP相关研究的经典指标。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)在糖尿病患者体内显著升高，并且和糖尿病视网膜病变、颈动脉内膜和中膜的厚度以及冠状动脉的钙化高度相关[20- 22]。ox-LDL可以作用于内皮细胞和巨噬细胞，导致炎症因子的释放[23- 24]。ox-LDL的形成和高血糖环境导致的氧化应激高度相关，且ox-LDL的升高常伴随白细胞介素(interleukin，IL)- 1β的升高[25]。

本研究检测了大鼠脊髓背角中RAGE/AKT通路的变化情况，观察了辛伐他汀是否可通过抑制脊髓背角中MAPKs的激活来缓解DNP的症状，并选用ox-LDL和IL- 1β来验证辛伐他汀的全身性抗炎抗氧化作用，探讨了辛伐他汀对糖尿病大鼠神经病理性疼痛及全身性炎症的影响及其机制。

材料和方法

材料辛伐他汀(中国上海TCI公司)，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美国Sigma公司)，血糖仪(中国三诺生物股份有限公司)，电子von-Frey(美国IITC公司)，BME- 410A热痛刺激仪(中国医学科学院生物工程研究所)，RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂(中国康为世纪公司)，磷酸酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、上样缓冲液、增强型显影液(中国北京普利莱公司)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜(美国Millipore公司)，anti-p-AKT抗体、anti-AKT抗体、anti-p-ERK抗体、anti-ERK抗体、anti-p-p38抗体、anti-p38 抗体、anti-p-JNK抗体、anti-JNK抗体、抗兔二抗(美国CST公司)，anti-RAGE抗体(中国北京博奥森公司)，anti-β-actin(中国北京中衫金桥公司)，抗鼠二抗(美国Abcam公司)，天能化学发光成像系统(中国上海天能公司)，ox-LDL酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(中国武汉新启迪公司)，IL- 1β ELISA试剂盒(中国上海江莱生物公司)。

糖尿病动物模型的建立雄性SD大鼠24只，体质量(235 ± 15)g，购自北京维通利华公司[许可证号：SCXK(京)2016- 0006]。动物房温度为(23 ± 1)℃，照明方案为12 h照明- 12 h黑暗。所有动物被饲养在糖尿病专用笼位中，由专门的饲养员每天更换垫料和添加食物、饮水。采用随机数表法将大鼠随机分为正常+介质(NV)组、糖尿病+介质(DV)组和糖尿病+辛伐他汀(DS)组3组，每组8只。大鼠在建模前禁食12 h。将STZ溶解于柠檬酸缓冲液中，配置成1% STZ溶液，置于冰上，0.5 h内使用完毕。DV组和DS组每只大鼠按照60 mg/kg的剂量接受STZ溶液腹腔注射，NV组接受相应体积柠檬酸缓冲液腹腔注射。STZ注射3 d后从各组大鼠尾静脉采血测血糖，血糖值>16.7 mmol/L视为建模成功，一次性建模成功率约为94%。DS组每天按照15 mg/kg的剂量接受辛伐他汀腹腔注射(剂量的选择依据相关文献[26])，NV组和DV组每天接受相应体积的溶剂腹腔注射。具体流程见图1。研究方案通过了北京协和医院实验动物福利伦理委员会的审核。

行为学检测

机械痛阈：采用电子Von-Frey检测大鼠的机械性刺激缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)。该设备由手持的压力传感器和1根直径为200 μm的钨丝组成。测试前，研究者将每只大鼠单独放置于金属网底的塑料隔间内，使其在安静环境中适应30 min。测试时，用金属探头垂直于足底缓慢加压，直到出现缩足反应，记录仪器显示的读数。每足测量3次，取平均值。

BG：血糖；BM：体质量；PWMT：机械性刺激缩足阈值；PWTL：热刺激缩足反射潜伏期；STZ：链脲佐菌素；Veh：介质；Sim：辛伐他汀；ip：腹腔注射；SDH：脊髓背角；BS：血清

BG：blood glucose；BM：body mass；PWMT：paw withdrawal mechanical threshold；PWTL：paw withdrawal thermal latency；STZ：streptozotocin；Veh：vehicle；Sim：simvastatin；ip：intraperitoneal injection；SDH：spinal dorsal horn；BS：blood serum

图1实验流程图

Fig1Flow chart of the experiment

热痛阈：采用BME- 410A热痛刺激仪检测大鼠的热刺激缩足反射潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。测试前，将每只大鼠单独放置于2 mm厚玻璃底的塑料笼内，使其在安静的环境中适应30 min。测试时，用热痛刺激仪分别照射大鼠左右后足底部，大鼠产生缩足或者舔足反应时停止照射，记录仪器显示的时间。每足测量3次，取平均值。

Western blot检测采用戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取血后迅速取出L3- 5段脊髓背角，放入冻存管中用液氮冷却，置于-80 ℃冰箱保存。每组用于Western blot检测的大鼠为5只。每10 mg组织加入100 μl包含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液，用超声充分匀浆裂解后在4 ℃条件下12 000 g/min离心15 min，取上清，加入5×上样缓冲液后用沸水煮蛋白10 min。上样后用10% SDS-PAGE分离蛋白，分离开的蛋白电转到PVDF膜上。非磷酸化指标的PVDF膜用5%脱脂奶粉在室温封闭1 h，磷酸化指标的PVDF膜用5% BSA封闭1 h，然后用相应的一抗在4 ℃条件下孵育过夜。再用相应的二抗在室温条件下孵育PVDF膜1 h。将PVDF膜用增强型显影液浸润，用天能化学发光成像系统成像。采用Image J图像分析软件对各条带进行分析。

ELISA检测采用ELISA试剂盒检测血清中ox-LDL和IL- 1β的浓度，具体参照厂家提供的产品说明进行。每组大鼠为8只。血清在建模后第28天取得。

统计学处理采用GraphPad Prism 6.0统计软件，计量资料以均数 ± 标准差表示；Western blot和ELISA检测结果采用单因素方差分析，组间比较采用Dunnett多重比较法；血糖、体质量和行为学数据采用重复测量数据两因素方差分析，组间比较采用Tukey多重比较法；Western blot检测条带统计分析时，将3组数据用NV组的平均值进行标准化；P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

辛伐他汀对糖尿病大鼠血糖、体质量和痛阈的影响建模后第7、14、21、28天，DV组的血糖水平分别为(24.0 ± 3.1)、(23.7 ± 2.5)、(24.2 ± 2.1)、(26.2 ± 1.1)mmol/L，均明显高于NV组的(6.8 ± 0.9)(q=25.584，P=0.000)、(7.0 ± 1.2)(q=24.840，P=0.000)、(6.1 ± 1.7)(q=26.979，P=0.000)、(6.5 ± 1.8)mmol/L(q=29.194，P=0.000)，与DS组的(24.2 ± 3.2)(q=0.279，P=0.979)、(24.7 ± 2.2)(q=1.451，P=0.562)、(24.3 ± 2.1)(q=0.130，P=0.995)、(24.7 ± 1.7)mmol/L(q=2.196，P=0.271)差异均无统计学意义。

建模后第7、14、21、28天，DV组体质量分别为(253.0 ± 16.8)、(260.6 ± 25.8)、(264.6 ± 33.4)、(263.0 ± 43.9)g，均明显低于NV组的(304.2 ± 17.2)(q=5.545，P=0.000)、(336.6 ± 19.6)(q=8.241，P=0.000)、(358.8 ± 11.4)(q=10.225，P=0.000)、(376.3 ± 11.8)g(q=12.284，P=0.000)，与DS组的(259.0 ± 19.3)(q=0.648，P=0.891)、(279.7±29.5)(q=2.077，P=0.310)、(280.8 ± 38.4)(q=1.766，P=0.427)、(285.1 ± 48.4)g(q=2.398，P=0.212)差异均无统计学意义。

建模后第7、14、21、28天，DV组的PWMT值分别为(10.4 ± 1.4)、(8.6 ± 0.8)、(7.1 ± 1.6)、(7.8 ± 0.8)g，NV组分别为(11.7 ± 1.1)、(12.0 ± 0.9)、(11.6 ± 1.5)、(11.7 ± 1.5)g，其中DV组第14(q=8.482，P=0.000)、21(q=11.309，P=0.000)、28(q=9.801，P=0.000)天的PWMT值明显低于NV组；DS组分别为(11.2 ± 0.7)、(9.9 ± 0.5)、(9.4 ± 1.4)、(9.7 ± 0.9)g，其中第21(q=5.780，P=0.000)、28(q=4.775，P=0.003)天的PWMT值明显高于DV组。

建模后第7、14、21、28天，DV组的PWTL值分别为(8.6 ± 1.2)、(8.1 ± 1.6)、(8.0 ± 0.7)、(7.6 ± 1.2)s，NV组分别为(8.7 ± 1.1)、(8.7 ± 1.0)、(8.3 ± 0.8)、(8.6 ± 0.7)s，DS组分别为(9.2 ± 1.3)、(8.8 ± 0.7)、(8.4 ± 0.7)、(8.7 ± 1.3)s，各组间差异均无统计学意义(P均 > 0.05)。

辛伐他汀对糖尿病大鼠脊髓背角中RAGE/AKT的影响DV组大鼠脊髓背角中RAGE的表达量明显高于NV组(q=6.299，P=0.000)，DS组明显低于DV组(q=2.891，P=0.025)；DV组大鼠脊髓背角中AKT磷酸化水平明显高于NV组(q=8.915，P=0.000)，DS组明显低于DV组(q=4.103，P=0.003)(图2)。

辛伐他汀对糖尿病大鼠脊髓背角中MAPKs的影响DV组大鼠脊髓背角中ERK(q=8.313，P=0.000)、p38蛋白(q=2.965，P=0.022)和JNK(q=7.459，P=0.000)的磷酸化水平明显高于NV组；DS组脊髓背角中JNK的磷酸化水平明显低于DV组(q=3.866，P=0.004)，ERK(q=1.987，P=0.122)和p38蛋白的磷酸化水平(q=1.260，P=0.375)与DV组差异无统计学意义(图3)。

辛伐他汀对糖尿病大鼠血清ox-LDL和IL- 1β的影响DV组大鼠的血清ox-LDL和IL- 1β水平分别为(41.86 ± 13.40)ng/ml和(108.16 ± 25.88)pg/ml，均明显高于NV组的(24.66 ± 7.87)ng/ml(q=3.606，P=0.003)和(49.32 ± 28.35)pg/ml(q=5.079，P=0.000)；也明显高于DS组的(18.81 ± 5.62)ng/ml(q=4.833，P=0.000)和(32.73 ± 11.73)pg/ml(q=6.510，P=0.000)。

讨 论

目前已知他汀类药物在糖尿病动物模型中可以改善神经组织的血流灌注和微循环[27- 28]，通过抑制RhoA/ROCK通路、上调NO表达[29]，缓解糖尿病导致的神经病变。本研究观察了辛伐他汀对DNP大鼠脊髓背角中与疼痛相关的分子蛋白RAGE/AKT和MAPKs的影响，证明辛伐他汀可能通过抑制脊髓背角中RAGE/AKT通路和JNK的磷酸化来缓解DNP。

本研究选用的模型为经典的STZ腹腔注射诱导的糖尿病模型。因为在糖尿病状态下，感觉神经的改变要早于运动神经的变化，且本研究的观察期为28 d，所以本研究主要关注了机械痛阈和热痛阈的变化。在热痛阈检测过程中，我们保持了大鼠充分安静、玻璃干燥以及恒温，固定热辐射灯泡的功率，以减少客观因素对热痛阈检测的影响，结果未在观测时间点发现糖尿病大鼠的热痛阈有显著的下降，与Daugherty等[30]和龚亚红[31]的热痛阈检测结果类似。研究显示，利用STZ建立1型糖尿病模型的给药剂量范围大概是50～72 mg/kg[32- 34]，本研究的给药剂量为60 mg/kg，因此可以排除STZ建模剂量不同导致的热痛阈下降无法检出。热痛阈的检测方法主要有热水浸尾实验[32-33]和热痛刺激仪法[34]，但研究中未说明热痛刺激仪的具体型号，因此我们推测，可能是因为热痛阈检测方法的不同或者检测设备的不同导致本研究未检出糖尿病大鼠热痛阈的下降。

RAGE：晚期糖基化终末产物受体；AKT：蛋白激酶B；NV：正常+介质；DV：糖尿病+介质；DS：糖尿病+辛伐他汀

RAGE：receptor for advanced glycation end products；AKT：protein kinase B；NV：normal+vehicle；DV：diabetic+vehicle；DS：diabetic+simvastatin

图2大鼠脊髓背角中RAGE/AKT通路的变化

Fig2Changes of RAGE/AKT pathway in the spinal dorsal horn of rats

ERK：细胞外调节蛋白激酶；JNK：c-Jun氨基末端激酶；MAPKs：丝裂原活化蛋白激酶

ERK：extracellular signal-regulated kinase；JNK：c-Jun N-terminal kinase；MAPKs：mitogen-activated protein kinases

图3MAPKs在大鼠脊髓背角中的变化

Fig3Changes of MAPKs in the spinal dorsal horn of rats

Bhalla等[26]采用7.5、15和30 mg/(kg·d)的剂量治疗长春新碱诱导的神经病理性疼痛，结果显示，15 mg/(kg·d)是缓解疼痛的最优剂量且对正常大鼠的机械痛阈以及血清胆固醇无明显影响，30 mg/(kg·d)的剂量不能有效缓解疼痛并且降低了正常大鼠机械痛阈和血清胆固醇浓度。因此本研究选用的辛伐他汀剂量为15 mg/(kg·d)，并且没有设置正常大鼠腹腔注射辛伐他汀组。

RAGE/AKT通路在糖尿病并发症研究中出现较多。糖尿病动物的血糖升高，长期的高血糖会导致体内的蛋白质发生糖基化，形成晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)，AGEs都是RAGE的配体，与RAGE结合后会引起下游信号通路的变化。Chiu等[10]研究发现，AGEs可以作用于RAGE，通过AMPK磷酸化来介导AKT的去磷酸化，进而导致小鼠糖尿病肌萎缩症的发生。在糖尿病导致的肾损伤研究中，AGEs可以作用于RAGE引发AKT 磷酸化，导致促炎和促纤维化因子的释放，进而引发肾小管间质性损伤[12]。可见在不同病理生理过程中，RAGE与配体结合后AKT的变化是不一样的。

RAGE和AKT与疼痛的发生密切相关。在大鼠腰椎间盘突出疼痛模型中，DRG中RAGE/STAT通路的激活在疼痛发生和发展中发挥重要作用[15]。在脊神经结扎模型中，注射中和RAGE的抗体可以有效缓解疼痛，抑制NF-κB、TNF-α和IL- 1β上调[16]。Guo等[17]研究发现，在大鼠CCI模型中，痛阈下降伴随着PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活。Guan等[18]在骨癌痛模型中也发现了PI3Kγ/AKT的激活与大鼠痛阈的下降密切相关，给予PI3Kγ的抑制剂后，骨癌痛相关的行为学改变得到缓解并且p-AKT的升高在一定程度上被抑制，这说明PI3Kγ/AKT的激活是骨癌痛发生发展的重要机制之一。本研究同时检测了大鼠脊髓背角中RAGE的表达和AKT的磷酸化，结果发现，辛伐他汀缓解机械痛的同时可以在一定程度上抑制糖尿病导致的RAGE/AKT激活，由此推测辛伐他汀抑制RAGE受体的表达，减少其配体与之结合进而减少AKT的磷酸化可能是辛伐他汀缓解DNP的另一个机制。

MAPKs在神经系统中的激活与各种疼痛的诱发以及维持都密切相关[35]，已经成为疼痛研究中的经典指标。Daulhac等[19]发现，DNP大鼠脊髓中的ERK、p38及JNK发生了广泛的激活，给予相应的抑制剂之后，机械痛得到缓解，可见MAPKs激活是DNP发生和维持的重要机制之一。本研究发现，DNP大鼠脊髓背角中的MAPKs也发生了广泛的激活，辛伐他汀可以提高糖尿病大鼠的机械痛阈并且抑制JNK的激活，但对ERK和p38的激活无明显抑制作用。由此推测，抑制JNK激活也是辛伐他汀缓解DNP症状的机制之一。

高血糖可以导致氧化应激反应的发生[36]，LDL暴露于活性氧簇容易形成ox-LDL[37]。已有研究证明，ox-LDL可以作用于单核巨噬细胞，激活NLRP3炎性小体，导致IL- 1β的释放[25]。本研究结果显示，辛伐他汀可以显著降低糖尿病大鼠血清中ox-LDL和IL- 1β的浓度，并推测辛伐他汀可能具有减轻糖尿病大鼠全身炎症反应的作用。本课题组的另一项研究发现，1型糖尿病大鼠脊髓背角中的IL- 1β相对于正常组无明显变化(数据未发表)，考虑可能是ox-LDL无法穿透血脑屏障所致。

本研究具有一定的局限性，一方面研究尚未阐明RAGE/AKT与JNK的具体作用关系，另一方面，取材的时间点均为第28天，脊髓背角中的蛋白和血清中的炎症因子只对应第28天的行为学，无法获知这些指标在观测期的动态变化。

综上，本研究结果显示，辛伐他汀可能通过抑制脊髓背角中RAGE/AKT通路的激活以及JNK的磷酸化缓解DNP的症状。此外，辛伐他汀也可以降低糖尿病大鼠血液中ox-LDL和IL- 1β的浓度，从而减轻DNP大鼠的全身性炎症反应。后续实验中可以做更深入的研究来阐明辛伐他汀缓解DNP和抗炎这两个非降脂作用的具体机制。