不同炎症因子对人牙周膜成纤维细胞促红细胞生成素肝细胞激酶受体和配体的影响

徐晓南，王梦琳，张 丁

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院口腔科，北京 100730

牙周膜是围绕牙根并连接牙与牙槽骨的致密结缔组织[1]，是感应力和生物刺激的重要结构，对维持牙周环境稳定和信号的传导起着重要作用。健康牙周组织可以维持骨代谢的动态平衡，但炎症微环境中骨平衡被打破，骨吸收大于骨沉积，骨量进行性吸收[2]，慢性牙周炎患者常表现为牙槽骨吸收，牙齿松动移位，出现牙间隙和早接触[3]，牙周病的治疗中常常需要正畸医师配合治疗关闭牙间隙，消除合干扰。认识炎症对牙周组织改建的作用机制对于正畸医生在临床上合理判断牙周炎患者正畸治疗风险及正确选择适应证尤为重要。

促红细胞生成素肝细胞激酶受体(erythropoietin producing hepatocyte kinase receptors，Eph)是酪氨酸激酶受体家族中最大的亚族[4]，目前在人类基因组中已发现 Eph 家族蛋白有14种受体[EphA(A1～A8)，EphB(B1～B6)]，8种配体[ephrinA(A1～A5)，ephrinB(B1～B3)]。Eph和ephrin 配体间的双向信号传导依赖于细胞的接触，可以影响细胞骨架和细胞与基质的附着[5]。在炎症反应中，Eph/ephrin 能松懈内皮或上皮屏障，促进白细胞的渗透和向组织的迁徙[6- 7]，目前的研究多局限在肺损伤模型[8]。近年研究发现，Eph 家族可以通过调控成骨-破骨耦联活动参与骨改建过程[9]，EphB4/ephrinB2可以抑制骨吸收、促进骨形成，EphA2/ephrinA2则促进骨吸收、抑制骨形成，Eph/ephrin 在炎症状态骨吸收过程中承担重要角色，但目前对 Eph 家族在炎症牙槽骨改建作用的研究较少。

本研究通过在体外构建人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)炎症模型，观察了炎症微环境中牙周膜成纤维细胞EphB4、ephrinB2、EphA2、ephrinA2在mRNA和蛋白水平随时间的变化趋势，探讨了肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-β)对hPDLFs Eph家族表达的影响，为进一步深入研究Eph家族蛋白在炎症环境中引起牙槽骨改建的具体作用机制提供生物理论基础。

材料和方法

主要材料和仪器hPDLFs(美国ScienCell公司)，DMEM培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Gibico公司)，炎症因子(TNF-α、IL- 1β，美国 Peprotech公司)，Trizol(美国Ambion)，PCR相关试剂盒(美国Promega公司)，HRP标记的羊抗兔二抗(美国Jackson公司)，EA2、ERA2、EB4、ERB2抗体(兔来源，英国 Abcam公司)，酶标仪(美国Varioskan Flash公司)，分光光度计(中国美谱达公司)，7500fast实时荧光定量基因扩增仪(美国 Applied Biosystems abi公司)，恒温CO2细胞培养箱(美国Thermo scientific公司)，生物安全柜(美国Bakes公司)，倒置相差显微镜(德国Leica公司)。

hPDLFs的培养采用完全培养基(89% DMEM+10% FBS+1% PS)培养hPDLFs，倒置相差显微镜在100倍下观察hPDLFs的生长情况和形态特征，待细胞铺满培养瓶80%～90%传代，实验用第5代细胞。

体外炎症模型建立将hPDLFs消化离心后制成细胞悬液，以2×104/ml的细胞密度接种于6孔板中，待细胞融合至80% 左右时分别加入10 ng/ml TNF-α和10 ng/ml IL- 1β炎症刺激，设立空白对照组(0 h)，培养时间为1、2、6、12、24 h。

Real-time PCR检测Eph受体和ephrin配体mRNA的表达变化Trizol法提取细胞总RNA，采用分光光度计测OD260/OD280、OD260/OD230，判断RNA纯度和浓度，以DEPC水为空白对照，OD260/OD280=1.8～2.2，OD260/OD230 >2用于后续实验。PCR所用引物采用Primer软件设计(表1)。使用Promega公司RT-PCR试剂盒逆转录合成cDNA，95℃预变性2 min，95℃ 3 s，60℃延伸30 s，热循环49次。采用2-△△CT法进行相对定量分析，以GAPDH为内参基因，检测待测样品中目的基因的表达水平。

Western blot观察Eph受体及ephrin配体的蛋白表达变化采用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)提取细胞蛋白，按照BCA法测定蛋白浓度，以RIPA调整蛋白浓度，样品终浓度为1 μg/μl，加入5×蛋白样品缓冲液，95℃ 5 min。根据目的蛋白的相对分子质量，配制10% 分离胶，5%浓缩胶，蛋白样品以每孔10 μg上样，浓缩胶恒压90 V，约20 min；分离胶恒压120 V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。300 mA恒流90 min将电泳胶的蛋白转移至PVCF膜，将膜完全浸没于5% BSA-TBST中，水平摇床孵育1 h(RT)进行封闭。之后5% BSA-TBST稀释一抗(EA2、ERA2、EB4、ERB2、GAPDH)，4℃水平摇床孵育过夜。次日洗膜后室温孵育二抗山羊抗兔IgG 40 min，将TBST漂洗好的膜置于暗盒，在膜表面滴加ECL反应3 min，胶片曝光显影，应用软件Gel Image system ver.4.00对图像进行灰度分析，计算目的蛋白灰度值与内参灰度值间的比值。

表1 PCR相关引物Table 1 The related primers of PCR

统计学处理采用SPSS 20.0统计软件，实验重复3次，所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVE)，P<0.05表示有统计学意义，应用Graphpad Prism软件绘制数据图。

结 果

hPDLFs形态学观察在倒置显微镜下观察hPDLFs的形态，结果显示实验所用第5代细胞生长情况良好，细胞贴壁生长，贴壁后初期呈星形，逐渐成长为梭形，胞浆丰满，彼此交联接触(图1)。

炎症因子刺激下hPDLFs Eph受体和ephrin配体mRNA的表达情况在10 ng/ml TNF-α和10 ng/ml IL- 1β刺激下，hPDLFs细胞膜上的Eph受体和ephrin配体在mRNA水平发生时间依赖性变化(图2)，两种刺激引起的变化趋势相似。TNF-α刺激hPDLFs 24 h内，ephrinA2 mRNA随刺激时间增加表达量逐渐升高(F=57.229，P<0.05)，且1 h内就有明显变化；IL- 1β刺激组在6 h时才出现明显升高(F=13.257，P<0.05)；24 h时 TNF-α组的表达量明显高于 IL- 1β组(P<0.05)。EphB4 mRNA表达在 TNF-α作用1 h时出现高表达现象，之后呈时间依赖性下降趋势(F=20.141，P<0.05)；IL- 1β组在短时间内有小波动，1 h后较 TNF-α组缓慢的下降，24 h时的表达量两组间差异无统计学意义(P>0.05)。EphA2(F=2.444，P>0.05)及 ephrinB2 mRNA表达量(F=3.048，P>0.05)在24 h内有小幅度变化，但差异均无统计学意义。

hPDLFs：人牙周膜成纤维细胞

hPDLFs：human periodontal ligament fibroblast

A.贴壁初期；B.6 d

A. initial stage；B.6 d

图1hPDLFs的形态(×100)

Fig1Morphology of hPDLFs(×100)

TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL- 1β：白细胞介素1β；Eph：促红细胞生成素肝细胞激酶受体；组内与0 h比较，aP<0.05；同时刻组间比较，bP<0.05

TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL- 1β：interleukin- 1β；Eph：erythropoietin-producing hepatocyte kinase receptors；aP<0.05 compared with 0h within the group；bP<0.05 compared with different group at the same time

图2炎症因子对hPDLFs Eph家族基因表达的影响

Fig2Effects of inflammatory factors on gene expression of hPDLFs Eph family

TNF-α刺激下hPDLFs Eph受体和ephrin配体蛋白的表达情况Western blot检测结果显示，ephrinA2 和EphB4蛋白水平与基因表达基本趋势一致，但蛋白水平的表达变化稍滞后于基因水平的变化。随刺激时间增加，ephrinA2的蛋白量逐渐增加(F=5.921，P>0.05)，EphB4在6 h内蛋白表达增加，6 h后呈下降趋势，降至24 h时明显低于0 h表达量(F=83.72，P<0.05)(图3)。

IL- 1β刺激下hPDLFs Eph受体和ephrin配体蛋白的表达情况Western blot检测结果显示，ephrinA2和EphB4的蛋白水平与基因表达趋势一致，随刺激时间增加，ephrinA2的蛋白量逐渐增加(F=23.731，P<0.05)，EphB4在短时间内蛋白表达量增加，6 h后逐渐下降，降至24 h时的表达量仍明显高于0 h(F=47.339，P<0.05)(图4)。

讨 论

目前研究常采用单一炎性因子或多种因子共同刺激实验细胞构建体外细胞炎症模型[10]，其中以TNF-α和IL最为常用。TNF-α是一种内源性调节因子，刺激黏附分子的分泌和趋化因子的产生[11]，可以诱导花生四烯酸代谢产物包括前列腺素E2产生，诱导成纤维细胞产生基质金属蛋白酶同时激活破骨细胞，导致牙周组织破坏[12]。有学者比较不同质量浓度的TNF-α对牙周膜干细胞成骨能力的影响，发现浓度越高抑制成骨能力越强，质量浓度为10 ng/ml时，成骨抑制效果最显著[13]。IL- 1β是免疫应答过程中的协调细胞因子，当受到炎症刺激时，IL- 1β可以影响细胞凋亡、增殖和分化，促进血管形成，增加吞噬细胞的募集，调控免疫细胞产生细胞因子和趋化因子，介导炎症反应[14]。本研究中采用高浓度IL- 1β(10 ng/ml)和TNF-α(10 ng/ml)分别刺激牙周膜成纤维细胞构建炎症模型，比较了两种炎症因子引起牙周膜成纤维细胞Eph家族表达变化的差异。

以往在内皮和上皮细胞的研究中发现，炎症早期阶段，EphA2和ephrinB2过表达，炎症晚期时EphB4表达降低，引起细胞间信号传导的转变发生炎症反应[8，15]。本研究结果显示，炎症因子刺激24 h内，ephrinA2基因表达和蛋白表达均呈递增趋势，EphB4的表达在短时间内出现升高，之后呈时间依赖性递减趋势，EphA2和ephrinB2的表达无明显变化。这种差异可能是由于外胚间充质来源的 hPDLFs在炎症微环境中的应答行为与上皮和内皮细胞不同有关。

Mr：相对分子质量；与0 h相比，aP<0.05

Mr：relative molecular mass；aP<0.05 compared with 0 h

图3炎症因子TNF-α对hPDLFs中Eph家族蛋白表达的影响

Fig3Effects of TNF-α on protein expression of Eph family in hPDLFs

与0 h相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with 0 h

图4炎症因子IL- 1β对hPDLFs中Eph家族蛋白表达的影响

Fig4Effects of IL- 1β on protein expression of Eph family in hPDLFs

2006年，Zhao等[16]和Mao等[17]在体外实验中发现，破骨细胞上ephrinB2配体介导的反向信号可抑制破骨细胞的形成，EphB4受体介导的正向信号可以增强成骨细胞的分化，促进骨形成，抑制骨吸收[18]。Wang等[19]在动物实验中发现，在炎症微环境中EphB4的表达减少，抑制成骨活性，促进破骨细胞分化，延迟骨再生。EphA2/ephrinA2双向传导作用可以促进骨吸收，同时抑制成骨细胞形成[20]。Gao 等[21]在实验中发现，牙周病致病菌牙龈卟啉单胞菌的脂多糖可以上调EphA2的表达，促进破骨细胞分化，抑制成骨细胞分化。Irie等[22]通过体外诱导实验证明，ephrinA2介导的反向信号可以显著促进破骨细胞的形成，EphA2的正向信号发挥抑制成骨细胞分化的效应。本研究结果与以上研究相符，牙周膜细胞在TNF-α及IL- 1β刺激下，促进骨吸收的ephrinA2在mRNA和蛋白水平的表达呈时间依赖性增强，而促进骨形成的EphB4则在短时间表达应激增高后呈下降趋势。此结果解释了炎症环境中骨吸收强于骨形成，骨平衡被打破，牙槽骨进行性吸收的临床现象。

有学者在体内实验中发现，敲除Efnb2(编码ephrinB2配体)基因的小鼠破骨细胞分化强，但其骨组织表型与野生型小鼠无明显差异。Zhao等[16]认为这可能是因为在破骨细胞分过程中，ephrinB1 介导的反向信号与ephrinB2 相似或者有其他的补偿因子可以维持体内的骨平衡。在Wang等[19]研究在炎症环境下阻断 ephrinB2 配体的表达，结果并不影响骨改建和骨再生的情况，作者认为在炎症状态下存在其他信号因子可以补偿 ephrinB2 的功能。本研究结果与以上研究结果相似，hPDLFs 在炎症刺激下 ephrinB2的表达无变化，可能是因为其他补偿信号因子较早做出应答，或受旁分泌等影响。本研究结果显示hPDLFs 在炎症刺激 24 h 内，ephrinA2 随刺激时间增加表达增强，而 EphA2 的表达并无明显变化，可推测在炎症微环境初期，hPDLFs 通过细胞膜上ephrinA2 介导的反向信号朝破骨向分化。近期有学者发现，牙周膜细胞 ephrinA2 在 LPS 刺激 24 h 内显著高表达[23]，与本研究结果一致，48 h 后 EphA2 的表达开始显著增加，该作者提出牙周膜细胞在炎症环境初期 ephrinA2 介导的反向信号促进骨吸收，之后通过 EphA2 正向信号抑制骨形成的可能。本研究在 24 h 内未观察到 EphA2 基因和蛋白水平的表达变化，在后续实验中需观察更长时间的表达情况。

本研究中，IL- 1β和TNF-α两种炎症因子引起 hPDLFs中Eph家族基因和蛋白的表达变化趋势相似，但 TNF-α作用下 Eph 受体和 ephrin 配体的基因应答更早，变化趋势更显著。TNF-α 被认为是炎症反应的启动物质，是其他促炎因子的上游因子[24]，能直接抑制成骨细胞活性，促进破骨细胞分化形成，最终导致骨形成不足[25]。IL- 1β则 不能直接促进破骨细胞前体细胞的分化，有研究证实，IL- 1β经成骨细胞产生细胞因子促进破骨细胞活化，通过成骨细胞产生信号传递至破骨细胞产生骨吸收[26]，其主要作用是延长破骨细胞寿命增强破骨细胞活性，从而增加其吸收骨的能力[27]。本研究中 IL- 1β和TNF-α两组间的差别可能与以上所述有关。

本研究仅观察到炎症因子可以引起牙周膜Eph 受体和ephrin 配体表达变化的现象，说明炎性因子对hPDLFs的作用有Eph受体和ephrin配体的参与，Eph受体和ephrin配体表达的变化是否会影响牙槽骨骨代谢的平衡，其具体作用机制还需要进一步深入研究。目前只研究了炎症对hPDLFs Eph4大亚族的影响，那么力和炎症共同作用下，Eph家族会做出怎样的应答，力学信号是否能够拮抗炎症因子的作用都需要更多更深入的研究，本研究的发现为深入研究Eph家族蛋白在炎症环境中引起牙槽骨改建的具体作用机制提供了初步的生物理论基础。

综上，炎症因子TNF-α和IL- 1β均可引起hPDLFs Eph受体和ephrin配体的表达变化，ephrinA2随刺激时间增加呈上升趋势，Eph4呈时间依赖性降低，两者引起Eph受体和ephrin配体的表达变化趋势一致，但TNF-α的作用更显著。