盐酸阿比朵尔体外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

张兴权，代军朋，蔡柏蔷

1美国加州大学 圣地亚哥医学院传染病系, 拉霍亚，加州 92093 2石家庄四药有限公司，石家庄 0521653中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院呼吸内科，北京 100730

·论著·

盐酸阿比朵尔体外抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的作用

张兴权1，代军朋2，蔡柏蔷3

1美国加州大学 圣地亚哥医学院传染病系, 拉霍亚，加州 92093
2石家庄四药有限公司，石家庄 052165
3中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院呼吸内科，北京 100730

目的检测盐酸阿比朵尔体外对2009新型流感病毒A(H1N1)复制的影响。方法采用2009新型流感病毒A(H1N1)感染MDCK细胞系统，检测盐酸阿比朵尔抗流感病毒的活性。血凝实验、细胞病变保护实验、RT-PCR 和定量RT-PCR实验用于病毒滴度确定。使用Chou软件系统计算药物50%抑制病毒浓度和50%毒性浓度。结果盐酸阿比朵尔在MDCK 细胞培养内显示毒性低(50%毒性浓度gt;100 μmol/L)，且明显抑制2009新型流感病毒A(H1N1)的复制。在血凝实验、细胞病变保护实验和定量RT-PCR检测中， 盐酸阿比朵尔50% 抑制病毒浓度分别为(5.5±0.9)、(3.4±0.8)和(1.5±0.2)μmol/L 。结论盐酸阿比朵尔明显抑制2009新型流感病毒A(H1N1)复制活性，而且具有诱生干扰素和免疫激活活性，作为一种抗流感病毒药物，它是有价值的。

盐酸阿比朵尔；2009新型流感病毒A(H1N1); RT-PCR

ActaAcadMedSin, 2012,34(2):126-129

目前，临床使用的抗流感病毒药物有4种，即金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(remantadine)、扎那米韦(zanamivir) 和奥司他韦(oseltamivir)[1-2]。前两种药物最大的问题是因迅速产生耐药病毒株而失去效果，因此在临床上的应用有限。扎那米韦和奥司他韦是流感病毒神经氨酸酶抑制剂，对流感A、B和猪流感病毒均有明显的抑制活性，其中口服的奥司他韦成为首选的一线药物，但是目前已发现针对扎那米韦和奥司他韦的耐药毒株。目前抗流感病毒药物靶点窄、数量少、价格不菲，发展活性强、价格便宜和作用于病毒不同靶点的新药势在必行。盐酸阿比朵尔(恩尔欣，arbidol) 系前苏联化学和制药研究院研制的一种新型抗流感病毒药物，目前已在少数国家临床使用[3]。 文献报道该药明显抑制季节性流感病毒复制，作用机制包括阻止病毒融合与复制、诱生干扰素、明显提高自身免疫力[4-5]， 但对猪流感病毒的作用报道较少。本研究采用生物学和分子生物学技术探讨盐酸阿比朵尔对2009新型流感病毒A(H1N1)复制的影响。

材料和方法

材料MDCK 细胞系、CCL34细胞购自美国标准生物品收藏中心。培养基使用Eagle’s Minimal Essential 10%胎牛血清、1.0 mmol/L丙酮酸钠, 0.1mmol/L MEM非必需氨基酸，1.5 g/L碳酸氢钠，1%青霉素/链霉素。2009新型流感病毒A(H1N1)为美国加州圣地亚哥医学院传染病系提供。培养基为DMEM, 牛血清白蛋白2%, Herpes缓冲液25 mmol/L, TPCK-胰蛋白酶(Worthington 生物化学公司，Lakewood, NJ, USA)2 μg/ml。盐酸阿比朵尔原料药为石家庄四药有限公司提供，奥司他韦由Hoffmann-La Roche公司提供。

药物毒性测定2.5×106/ml MDCK 细胞悬液 200 μl 被种入96孔培养板内，37℃、5% CO2孵箱内培养24～48 h致细胞单层长成。药物被连续4倍稀释，最高浓度为100 μmol/L, 每个药物浓度为3孔。细胞毒性测定使用MTS(试剂盒 购自Promega公司, Madison, WI, USA)法，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

药物活性测定2.5×106/ml MDCK 细胞悬液 200 μl 被种入96孔培养板内，37℃ 、5% CO2孵箱内培养48 h致细胞单层长成。配制病毒悬液至100倍50%细胞感染的病毒量, 含有细胞单层的每孔加入50 μl 病毒悬液，之后在37℃、5% CO2孵箱内培养2 h。用病毒培养基洗细胞1次， 然后在培养板内加入4倍稀释的药物，最高药物浓度为50 μmol/L。 培养72 h后镜下观察细胞病变程度，并收获上清，用于血凝实验、RT-PCR和 定量RT-PCR实验。同时，观察细胞病变(cytopathic effect, CPE)。奥司他韦作为阳性对照药。

血凝实验：准备1个V型底的96孔板，每孔内加入50 μl 收获的上清液。随后，50 μl 1% 豚鼠红细胞加入每孔， 并轻轻混匀。室温下放置 1 h。阴性结果是红血球斑点集聚在孔中央，阳性结果是整个孔底形成均匀的红色，病毒滴度是产生阳性反应的最高稀释度值。

CPE：在病毒感染和药物处理72 h后，镜下观察给药和病毒对照组病毒对细胞产生的致病变作用。 lt;25% CPE为“+”,25%～50% CPE为“++”, 50%～75%为“+++”，gt;75%为“++++”。

RT-PCR：收获培养3d的细胞上清液，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN Sciences，MD，USA)提取流感病毒RNA,具体实验程序严格按照试剂盒说明书进行。被提取的病毒RNA储存在-70℃待用。随后, 一步法RT-PCR 核酸放大在PCR 仪(C1000 Peltier Thermal Cycler，BIO-RAD Laboratories, Inc, CA, USA)内进行。正义引物序列：5’-GTCCTATAAACACCAGCCTYCCA-3’；反义引物序列：5’-CGGGATATTCCTTAATCCTGTRGC-3’。反应条件：50℃，30 min，逆转录；95℃，15 min。 94℃，15 s； 55℃，15 s；72℃，30 s；共40个循环。 RT-PCR产物经 1% 琼脂糖凝胶分析，2009新型流感病毒A(H1N1)血凝毒(hemagglutinin, HA)的大小为115 bp。

定量RT-PCR：病毒RNA 与RT-PCR实验中使用的相同。 定量RT-PCR采用一步定量RT-PCR试剂盒(Superscript Ⅲ Platinum One Step Quantitative RT-PCR System，Invitrogen)。核酸放大在PCR 仪(Applied Biosystems 7900 HT Fast Real-time PCR system，Life Technologies，CA, USA)内进行。引物：SWINFA-F-20: 5’-GCACGGTCAGCACTTATYCTRAG-3’；SWINFA-R-20：5’-GTGRGCTGGGTTTTCATTTGGTC-3’。探针: SWINFA-P-5FAM-CYACTGCAAGCCCA(T-BHQ1)AC- ACACAAGCAGGCA-SpacerC3。反应条件: 50℃，30 min；95℃，10 min。95℃，15 s变性；60℃ 1 min退火/伸展；共40个循环。

统计学处理50% 抑制浓度(inhibition concentration 50%, IC50)、50% 毒性浓度(cytotoxic concentration 50%, CC50)由 Chou Dose Effect Program 软件计算决定[6]。

结 果

盐酸阿比朵尔对2009新型流感病毒A(H1N1)的抑制活性盐酸阿比朵尔对MDCK细胞毒性作用小，CC50gt;100 μmol/L。当病毒预先感染细胞2 h后加入系列稀释的药物，3 d 后检测HA 滴度，计算ID50为(5.5±0.9) μmol/L。 若将药物和病毒同时加入细胞培养，药物的IC50为(5.1±1.2)μmol/L, 与病毒预先感染2 h差异无统计学意义。奥司他韦用于阳性对照，在病毒预先2 h感染细胞，ID50为(0.15±0.03) μmol/L。

在病毒预先感染细胞2 h后加入药物，3 d后显微镜下观察CPE，细胞对照组为发现病变，病毒对照组病变为“++++”，当药物浓度依次为50、25、12.5、6.25 和3.125 μmol/L时，CPE 顺序为 “-”, “+”，“++”， “++”, “+++” (图1)。计算 IC50为(3.4±0.8)μmol/L。

A-E.盐酸阿比朵尔系列浓度为50, 25, 12.5, 6.25,3.125 μmol/L; F.病毒对照；G.细胞对照A-E.arbidol concentrations 50, 25, 12.5, 6.25,3.125 μmol/L; F.virus control; G.cell control图1 盐酸阿比朵尔对流感病毒致细胞病变的保护作用Fig 1 Protection of arbidol against cytopathic effect caused by influenza virus infection in MDCK cells

1-5：盐酸阿比朵尔浓度分别为 25、12.5、6.25、3.125和1.5625 μmol/L；6：病毒对照1-5：arbidor concentrations are 25, 12.5, 6.25, 3.125, and 1.5625 μmol/L respectively;6: virus control图2 RT-PCR方法检测盐酸阿比朵尔对流感病毒复制的抑制作用Fig 2 Inhibitory effect of arbidol on influenza virus replication (RT-PCR)

盐酸阿比朵尔对病毒核酸复制的影响在加入药物 3 d 后, RT-PCR 实验结果显示：25 μmol/L的盐酸阿比朵尔明显抑制病毒核酸产生，2009新型流感病毒A(H1N1)具有HA特异的115 bp带缺失；与病毒对照相比，12.5、6.25和3.125 μmol/L盐酸阿比朵尔也在一定程度上减少病毒核酸的复制(图2)。在定量RT-PCR实验中，未使用药物的病毒对照组病毒RNA 拷贝数 (×106)为 4.66±0.59;当药物浓度依次为25、12.5、 6.25 、3.125、1.5625和0.7813 μmol/L时，病毒 RNA 拷贝数分别为 0.25±0.11、0.18±0.08、0.67±0.38、2.56±0.83、2.03±0.48和2.33±0.48(图3)。计算 IC50为(1.5±0.2)μmol/L。

图3 定量RT-PCR方法检测盐酸阿比朵尔对流感病毒复制的抑制作用Fig 3 Inhibition of arbidol hydrochloride against influenza virus replication, as shown by quantitative RT-PCR

讨 论

在过去的100多年内，人流感病毒曾造成全球4次大流行，它们分别是1918年西班牙流感(A，H1N1)、1957年亚洲流感(A，H2N2)、1968年香港流感(A，H3N2) 和2009新型流感病毒A(H1N1)，亦称猪流感病毒(swine flu virus) 感染[7]。2009新型流感病毒A(H1N1)流行已造成全球近万人死亡，前3次流感大流行分别造成成百万到上千万人死亡，即使未发生流感大流行的年代，全世界每年也有25万人死于流感并发症[7-8]，因此防治流感及其并发症的研究成为保障人类健康的重要课题。虽然流感病毒疫苗能有效地减轻感染的流行，但是流感病毒的抗原漂移和基因重组阻碍了疫苗的使用和效果，因此抗流感病毒的化疗药物在防治流感上发挥着重要的作用。

由于抗流感病毒化疗药物金刚烷胺和金刚乙胺临床使用后迅速产生耐药病毒株，致使其逐渐淡出第一线选择的临床药物。扎那米韦和奥司他韦虽然具有较强的抑制流感病毒能力，但是逐渐显现出的耐药病毒株也给其临床应用带来隐患[9]。此外，这两种药物价格较贵，致使在临床上不能广泛使用，尤其在发展中国家。更严峻的问题是抗流感病毒感染的药物种类太少，所针对的病毒靶点窄，这给联合用药和替换用药带来困难。 针对上述问题的种种举措正在深入发展中， 如为了控制猪流感病毒的流行，美国食品及药物管理局特例批准可用尚未上市的帕拉米韦(peramivir) 治疗对奥司他韦耐药的流感患者[10]。另外，一些作用于其他靶点的如针对病毒HA 蛋白、病毒RNA 聚合酶蛋白以及病毒神经氨酸酶的新药正在研制当中[11]。

盐酸阿比朵尔是从俄国引进的一种抗流感病毒感染的药物。与奥司他韦不同，该药不是病毒神经氨酸酶抑制剂，它在细胞培养中对季节性流感病毒IC50在10～20 μmol/L, CC50在100 μmol/L左右[4-5]。本研究结果显示盐酸阿比朵尔在体外细胞培养实验中对2009新型流感病毒A(H1N1)复制也具有抑制活性。IC50分别为5.5 (HA测定)、3.4 (CPE实验)和1.5 μmol/L (定量RT-PCR)。本研究还确定盐酸阿比朵尔对MDCK 细胞的毒性，TC50gt;100 μmol/L。尽管盐酸阿比朵尔抑制流感病毒活性较低于奥司他韦，但盐酸阿比朵尔还有诱生干扰素和活化巨噬细胞作用， 且该药作用于病毒HA新靶点，价格稍便宜，因此盐酸阿比朵尔是有广泛应用前途和有价值的抗流感病毒药物。

为了让更多的国家和地区接受盐酸阿比朵尔，一些深入的研究应该进行，包括盐酸阿比朵尔与已知临床药物的协同作用研究、盐酸阿比朵尔对奥司他韦等耐药株的作用。此外，盐酸阿比朵尔的作用机制应更准确地揭示和阐明。

综上，盐酸阿比朵尔在细胞培养中明显抑制季节性流感病毒和2009新型流感病毒A(H1N1)的复制，且毒性较低，加之考虑到该药有诱生干扰素和免疫激活作用，价格低于奥司他韦， 因此认为盐酸阿比朵尔是有价值的抗流感病毒感染的药物。

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Thein-vitroEffectsofArbidolHydrochlorideAgainst2009NewInfluenzaVirusA(H1N1)

ZHANG Xing-quan1，DAI Jun-peng2，CAI Bai-qiang3

1Infectious Disease Division, Medical School, University of California, San Diego L Jolla CA 92093，USA
2Shijiazhuang No.4 Pharmaceutical Co. Ltd，Shijiazhuang 052165, China
3Department of Pulmonary Medicine,PUMC Hospital,CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

Corresponding auther: CAI Bai-qiang Tel: 010-69155039, FAX: 010-65231169,E-mail: caibq2009@hotmail.com

ObjectiveTo detect thein-vitroeffects of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1).MethodsThe activity of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1) was determined in MDCK cell cultures. Hemagglutination assay, observation of cytopathic effects, RT-PCR and quantitative RT-PCR tests were performed for determination of virus titers. Inhibition concentration 50% and cytotoxic concentration 50% were calculated with Chou’s Menu of Dose-Effect Program.ResultsArbidol hydrochloride showed low cytotoxicity (cytotoxic concentration 50%gt;100 μmol/L)and significant anti-2009 new influenza virus A (H1N1) activity in cell cultures. Inhibition concentration 50% were (5.5±0.9), (3.4±0.8), and (1.5±0.2) μmol/L in hemagglutination assay, cytopathic effect test, and quantitative RT-PCR assay, respectively.ConclusionArbidol has low cytotoxicity and high anti-virus activity and can effectively trigger the activities of interferon and immune response, and therefore can be a valuable anti-influenza virus drug.

arbidol hydrochloride; 2009 new influenza virus A (H1N1); RT-PCR

蔡柏蔷 电话：010-69155039，传真：010-65231169,电子邮件：caibq2009@hotmail.com

R 978.7； R373.1+3

A

1000-503X(2012)02-0126-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2012.02.005

2011-05-26)