一株猪源屎肠球菌的分离及其种属鉴定

张利勃，张 瑞，王小杰，谢双语，高慎阳

（辽宁医学院畜牧兽医学院畜产品质量与工程重点实验室，辽宁 锦州 121001）

一株猪源屎肠球菌的分离及其种属鉴定

张利勃，张 瑞，王小杰，谢双语，高慎阳⋆

（辽宁医学院畜牧兽医学院畜产品质量与工程重点实验室，辽宁 锦州 121001）

为分离出可用作猪用微生态制剂的肠道益生菌株，本研究选择锦州市凌海大业乡生态猪场为试验采样点，采集10日龄左右健康仔猪肠道粪样12份。利用MRS琼脂培养基分离培养初筛目标分离菌株的形态特征和培养特性，再通过生理生化鉴定法和16SrRNA基因分子鉴定法，最终确定1株分离菌为屎肠球菌，并命名为LN/ EF1312株，为后续肠道益生球菌的益生功能研究奠定了物质基础。

仔猪；屎肠球菌；16SrRNA；益生菌

肠球菌是动物和人体消化道内正常存在的一类微生物，由于其在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力，保证了其益生性能的发挥，尤其近年来益生菌制剂作为饲用抗生素替代产品之一越来越受到人们的重视，加之兼性厌氧的生理特性，使其与厌氧培养保存条件苛刻的双歧杆菌相比，更适合于生产和应用[1]。早在2008年，我国农业部第1126号就公告公布了允许使用的饲料添加剂品种目录，其中微生物饲料添加剂有16种，屎肠球菌（Enterococcus faecium）粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）和乳酸肠球菌（Lactococcus lactis）都包括在内。研究表明，优良的益生菌菌株主要来自动物体内，能够耐受胃肠道内环境生长快能产乳酸抑制病原菌生长及能够在肠道内定植[2-3]。本试验从10日龄健康仔猪新鲜粪便中分离出1株肠球菌，经种属特异性鉴定为一株屎肠球菌，这为开发饲用益生菌产品提供了参考菌株来源。

1 材料与方法

1.1 材料试验样品采自于锦州市凌海大业乡生态猪场仔猪新鲜粪便12份。质控屎肠球菌ATCC35667购自南京便诊生物科技有限公司；MRS培养基购自青岛海博生物技术有限公司；肠球菌菌属生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂有限公司；革兰氏阳性菌基因组提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker等均购自北京康为世纪生物科技有限公司。引物合成与基因测序委托上海生物工程有限公司完成。

1.2 细菌的分离与纯化在无菌操作台内，取粪便样品各1 g，用无菌的生理盐水10倍连续稀释至10-5，分别取10-3、10-4、10-5三个稀释度的悬液50μL涂布于MRS选择平板培养基上，做好标记。37℃兼性厌氧条件下连续培养36～48 h，挑取疑似单菌落，反复划线分离至获得纯菌株，并进行革兰氏染色镜检观察菌体形态和纯度。经纯化无杂菌者保存4℃冰箱备用。

1.3 菌落形态与染色特征观察将分离纯化的菌株涂布于MRS固体培养基平板上，以不同温度范围内以兼性厌氧条件下分别培养24～48 h后，进行菌落形态观察，并挑取菌落涂片镜检。将初步鉴定为肠球菌的菌落接种于MRS肉汤中纯培养，以便下一步生化试验鉴定[4-5]。

1.4 分离菌株生化鉴定依据伯杰系统细菌学手册的标准及肠球菌属生化鉴定管的说明进行分离菌的一系列生化试验鉴定。

1.5 分离菌株属种特异性分子鉴定

1.5.1 细菌模板DNA的制备 参照革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行，提取产物作为模板DNA，并采用分光光度计和电泳法计算DNA的含量及纯度。检验合格保存于-20℃备用。

1.5.2 种属特异性分析 在参考王亚宾等设计的肠球菌16S rRNA基因扩增属特异性引物（见表1中E1、E2）和Char lene R等设计的肠球菌种特异性引物（见表1中FM1、FM2）基础之上[5-6]，进行多重PCR扩增分析。PCR反应体系为30μL，其中含2× Taq MasterMix15μL，模板DNA 1μL，ddH2O 8μL，3对引物上下游引物各1μL。扩增程序如下：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，49℃退火复性30 s，72℃延伸30 s，进行30个循环后72℃终延伸10 min。取10μL扩增产物进行电泳，琼脂糖凝胶为1%，用凝胶成像系统记录结果。

表1 肠球菌种属特异性引物列表Table1 Enterococcus species-specific primers list

1.5.3 16S rRNA基因测序分析 将上述属特异性PCR扩增产物胶回收后经上海生工测序，并利用在线Blast分析分离菌株16S rRNA基因归属。

2 结果

2.1 菌落形态特征及染色特性经筛选，分离出一株疑似肠球菌菌株。该菌株在MRS固体平板培养基上菌落特征一致：灰白色、圆形、边缘整齐、表面光滑而有粘性；革兰氏染色为G+，菌体形态为球形，成对或短链状排列，见图1。

图1分离菌株纯化后革兰染色镜检结果Fig.1 Gram staining results of purified isolates

2.2 生理生化特性生化试验表明，该菌为兼性厌氧菌，在10～45℃条件下均能生长，发酵葡萄糖产酸但不产气，产生亮氨酸氨基肽酶（LAP酶），能水解亮氨酸-ß-萘酰胺；能在含有6.5%NaCl肉汤中生长，并能水解七叶苷，过氧化氢酶试验及氧化酶试验均为阴性，以上这些生化反应与常见细菌鉴定手册中肠球菌属的描述完全相符。

2.3 分子鉴定结果扩增产物经电泳可见16S rRNA基因在约1 096 bp和215 bp处均有一条特异性亮带，与预期片段大小相符（见图2），该结果与基因测序结果相符；而粪肠球菌特异性引物未扩增出360 bp条带。

图2 PCR鉴定结果Fig.2 PCR identification results

3 讨论

肠球菌在自然界分布广泛，人、动物肠道，食品、物料及少数临床样品中均有存在，本试验对10日龄仔猪新鲜粪便进行了肠球菌的分离，经生理生化和16S rRNA基因分子鉴定，结果显示，分离到一株屎肠球菌、命名为LN/EF1312株。由于屎肠球菌表型差异较大，易与屎肠球菌群其他细菌发生混淆，这给生化鉴定方法增加了困难，本次测定的猪的屎肠球菌符合率大于50%仅有3株，而进一步经多重种属特异性PCR鉴定后仅有1株符合率达90%为确切的屎肠球菌，所以采用16S rRNA基因序列这个分子钟（molecular clock）来评估细菌间的相关性和鉴定未知细菌属和种水平是非常必要的[8]。由于本试验将传统微生物分离筛选与细菌种属决定基因分子鉴定的方法相结合，使得目标益生菌株筛选效率显著提高，试验中所积累的经验方法与试验数据可为后续大量准确筛选肠猪道益生菌株工作奠定坚实基础。同时，本实验室将对本试验中所分离屎肠菌LN/EF1312株进行后续研究，即该菌株在消化道内是否能够发挥益生作用，如影响动物的营养代谢、产生非特异性免疫调节因子、产生干扰素或作为免疫复活剂刺激胃肠非特异性局部免疫等。

4 结论

本研究成功地从仔猪肠道内分离到一株屎肠球菌，经种属特异性鉴定后命名为屎肠菌LN/EF1312株，为猪用微生态制剂的研制提供了参考菌源。

[1]李金钟.肠球菌分类与鉴定新进展[J].临床检验杂志，2006，03：228-230.

[2]周霞，王晓兰，剡根强，等.肠球菌研究进展[J].石河子大学学报（自然科学），2008，06：708-712.

[3]王亚俊.基于基因组的屎肠球菌进化和功能研究[D].上海交通大学，2012，1：125.

[4]李梅，李卫芬，姚江涛.猪源肠球菌的分离及鉴定[J].上海畜牧兽医通讯，2007，（3）：50-51.

[5]路娟，刘文博，姜英，等.粪肠球菌和屎肠球菌的耐药特征[J].中华医院感染学杂志，2006，10：1169-1171.

[6]王亚宾，陈丽颖，胡慧，等.猪源粪肠球菌和屎肠球菌多重PCR快速鉴定方法的建立[J].动物医学进展，2010，S1：127-131.

[7]Char lene R J,Paula J F,John B B.Use of a Genus-and Species-Speci f ic Mul tiplex PCR for Identi f ication of Enterococci[J].Journal of Cl inical Microbiology,2004,42(8):3558-3565.

[8]Ehrmann M A,Kurzak P,Bauer J,et al.Characterization of lactobacil l i towards their use as probiotics adjuncts in poul t ry[J].Journal of Appl ied Microbiology,2002,92:966-975.

（编辑：张婷婷）

Isolation and species identification ofan enterococcus faecium from piglets feces

Zhang Libo,Zhang Rui,Wang Xiaoj ie,Xie Shuangyu,Gao Shenyang*
（Key Laboratory of Animal Products Quality and Engineering,Col lege of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Liaoning Medical University,Liaoning Jinzhou 121001）

In order to isolate the intestinal live strains which can be used to develop probiotics additive for pig,a ecological pig farm in Daye township of Linghai in Jinzhou city were selected for gathering intestinal fecal samples of heal thy piglets with about 10-day age.The total 12 samples were isolated cul tured using MRS agar medium at the beginning,then isolated st rain clones with the classic cul ture features and morphological characteristics,were subsequent ly identi f ied through the physiological and biochemical assay method combining with 16S rRNA gene molecular identi fication method,final ly a confirmed isolated strain of enterococcus faecium was named LN/EF1312 strain.This resul t provide foundation for the research on the function of l ive intestinal enterococcus.

Piglets;Excrement enterococcus;16S rRNA;Probiotics

S852.6

：B

：1672-9692(2014)02-0041-03

2013-12-11

作者简历：张利勃（1974-），男，硕士研究生，副教授，主要从事微生物与免疫学研究工作。

高慎阳（1979-），男，博士在读，副教授，研究生导师，研究方向为微生物与免疫学。

辽宁医学院校企合作横向课题（LY20110301），辽宁省农业科技攻关重点项目（2011214001），国家自然基金（青年项目，31101798）