PCV2灭活疫苗对小鼠的免疫效果研究

朱国坡，李少丽，邵攀峰，王斌卿，李新华,2⋆

（1.杭州荐量兽用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018；2.中国农业科学院家禽研究所，浙江 扬州 225125）

PCV2灭活疫苗对小鼠的免疫效果研究

朱国坡1，李少丽1，邵攀峰1，王斌卿1，李新华1,2⋆

（1.杭州荐量兽用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018；2.中国农业科学院家禽研究所，浙江 扬州 225125）

本研究首先用猪圆环病毒2型种毒攻击Balb/c小鼠，通过病毒分离，找出可使全部小鼠感染的最低病毒含量，然后用该种毒攻击免疫后的Balb/c小鼠，评价免疫保护情况。结果显示，可使小鼠全部感染的种毒最低病毒含量为106.5TCID50/0.1 m L，当疫苗病毒含量为105.5TCID50/0.1 m L时即可使7/10免疫小鼠得到保护，达到了疫苗的免疫效果。该研究为现有疫苗的生产工艺改进提供了重要的参考数据。

猪圆环病毒2型；病毒分离；疫苗

近年来，以猪圆环病毒2型（PCV2）为主要病原引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸系统混合疾病（PRDC）、猪繁殖障碍症等综合征候群给养猪业造成了巨大的经济损失，据报道，在欧洲该类病每年就可造成约6亿欧元的损失[1-3]。目前，预防该类疾病的首选是应用疫苗免疫接种。在我国，已有上市的商品化疫苗6种，其中勃林格殷格翰动物保健（美国）有限公司的PCV2亚单位疫苗的安全性及有效性都得到了试验肯定，然而该疫苗价格昂贵[4]。我国自主品牌疫苗均为全病毒灭活苗，由于病毒体外增殖能力差，抗原含量普遍不高，生产中批间质量较难统一，免疫效果评价困难，生产工艺需要进一步改进，疫苗质量有很大的提升空间[5-6]。本研究依据现有疫苗质量标准，首先用自制的PCV2灭活疫苗免疫小鼠，然后攻毒并进行病毒分离，探索合格疫苗的最低抗原含量，为疫苗生产工艺改进提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂PCV2灭活疫苗（O/W）、PCV2种毒（ZJ/C株）、PK15细胞均由杭州荐量兽用生物制品有限公司制备和保存；MEM营养液、胎牛血清购自Gibco公司；Balb/c雌性小鼠，SPF级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；PCV2单克隆抗体购自浙江同点生物科技有限公司；FITC-羊抗鼠抗体购自美国KPL公司。

1.2 PCV 22对小鼠的致病性取6～8周龄Balb/c小鼠40只随即分成A、B、C、D共4组，每组10只。各组小鼠分别用病毒含量为105.5、106.0、106.5、107.0TCID50/0.1 mL的PCV2种毒攻击，腹腔注射0.45 mL/只，另设10只小鼠作为不注射空白对照组。接种后21 d，扑杀所有小鼠，无菌采集所有小鼠脾脏进行病毒分离，分离到病毒即判为病毒分离阳性。

1.3 猪圆环病毒22型灭活疫苗最小免疫剂量试验该方法参照“猪圆环病毒2型灭活疫苗（ZJ/C株）质量标准中“小鼠免疫攻毒法”进行[7]。取抗原 病 毒 含 量 分 别 为 105.0、 105.5、 106.15、 106.5TCID50/0.1 mL的猪圆环病毒2型灭活疫苗分别腹腔注射免疫6～8周龄Balb/c小鼠各10只，每只0.2 mL，同时设10只不免疫小鼠作为对照。免疫后21 d，连同对照小鼠，用100%使小鼠致病的PCV2种毒攻击，每只小鼠腹腔注射0.45 mL。攻毒后21 d，扑杀，取脾脏进行病毒分离，分离到病毒即判为病毒分离阳性，分离不到病毒即为保护。

1.4 病毒分离

1.4.1 组织处理 取小鼠脾脏，按每0.05 g组织加入1 mL无菌的MEM无血清培养液后，研磨制备匀浆，反复冻融3次。组织匀浆以12 000 r/min离心10 min，收集上清，用0.22μm的一次性针头滤器过滤除菌，-20℃保存备用。

1.4.2 分离培养 PK15细胞单层用0.02%EDTA-0.05%胰酶在37℃条件下消化6～10 min，用含8%胎牛血清的MEM细胞生长液制成浓度为2×105个/mL细胞悬液，按照1.5 mL/孔将细胞悬液加入到12孔细胞培养板，置37℃、5%CO2培养箱培养24 h。取小鼠脾脏组织悬液各0.15 mL，分别接种到以上细胞板中，轻轻震荡混匀，置37℃、5%CO2培养箱继续培养48 h，收获细胞板，反复冻融3次，12 000 r/min离心10 min，取上清液作为第1代接种物。取第1代接种物按上述方法再盲传1代，作为第2代接种物。

1.4.3 检测 将用含8%胎牛血清MEM营养液制备的2×105个/mL的PK15细胞悬液加入到96孔细胞板中，每孔100μL，然后取上述第2代接种物10μL同步接种于96孔板中，每个样品2孔，同时设PCV2阳性对照和细胞空白对照各2孔。37℃、5%CO2培养箱培养72 h，弃细胞培养液，每孔加入100μL冷丙酮固定液，-20℃固定30 min，弃固定液，自然晾干备用。

1.4.4 结果判定 参照Tischer等[8]、崔尚金等[9]方法进行间接免疫荧光IFA鉴定，一抗为PCV2单克隆抗体，二抗为FITC-羊抗鼠荧光抗体。在倒置荧光显微镜下观察结果。阳性对照孔应出现绿色荧光，阴性对照孔应无绿色荧光，样品孔有绿色荧光细胞的判为阳性，无绿色荧光细胞的判为阴性。

2 结果和分析

2.1 PCV 22对小鼠的致病性通过病毒分离可以看到，小鼠样品病毒分离阳性的在荧光显微镜下可见到翠绿色荧光，并且无干扰背景，而空白对照组未见荧光（见图1）。其中，种毒病毒含量为105.5TCID50/0.1 mL时病毒分离阳性数为6/10，种毒病毒含量为106.0TCID50/0.1 mL时病毒分离阳性数为9/10，种毒病毒含量为106.5和107.0TCID50/ 0.1 mL时病毒分离阳性数均为10/10，空白对照组病毒分离阳性数为0/10（见图2）。据此结果选择10/10使小鼠致病最低病毒含量种毒的C组作为小鼠免疫攻毒用种毒，即106.5TCID50/0.1 mL。

图1 攻毒小鼠病毒分离间接免疫荧光检测（×200）Fig.1 The viral isolation result of injected m ice by IFA(× 200)

图2 PCV2对Ba lb/c小鼠的致病性Fig.2 The pathogenicity of PCV2 on Balb/c m ice

2

2.2 猪圆环病毒2型灭活疫苗最小免疫剂量试验当疫苗中抗原病毒含量为105.0TCID50/0.1 mL时可使小鼠5/10保护，当疫苗中抗原病毒含量为105.5TCID50/0.1 mL时可使小鼠7/10保护，当疫苗中抗原病毒含量为106.15TCID50/0.1 mL以上时可使小鼠10/ 10保护，见表1。

表1 猪圆环病毒2型灭活疫苗对小鼠的最小免疫剂量试验Table1 The m inimum immune dose of PCV2 inactivated vaccine on m ice

3 讨论

评价动物疫苗免疫效果的最直接方法是对试验动物的免疫攻毒。由于猪圆环病毒病的发病率高达50%，阴性猪难以筛选[1]，再者猪体试验费用高，因此选用替代动物来评价免疫效果是十分必要的。由于小鼠和猪的亲缘关系较近,遗传学背景清楚,具有价廉、试验周期短、易于饲养和操作等优点,许多疾病可以此为动物模型进行相关研究。国外，Kiupel等[10]、Quintana等[11]证实PCV2可以感染Balb/c小鼠，为后续研究提供了重要依据。我国现有PCV2疫苗的ZJ/C株和SH株的效果评价也已选用Balb/c小鼠作为替代动物，其中SH株采用ELISA测抗体法，ZJ/C株采用分离病毒的方法。

ELISA抗体检测法由于方便、快捷省时、成本低廉被许多学者所采用。董信田等[12]通过ELISA方法检测小鼠抗体，证实PCV2油佐剂和铝胶佐剂灭活疫苗免疫小鼠后均能产生较好的免疫应答，并且油佐剂灭活疫苗免疫效果好于铝胶佐剂灭活疫苗。王建龙等[13]用制备的PCV2 DNA疫苗免疫小鼠，发现免疫后第14天小鼠血清ELISA抗体水平达到峰值，加强免疫后抗体水平无显著变化。而病毒分离方法结果判定更为直接，并且也最为准确可靠。因此，本研究中也采用免疫攻毒后分离病毒的方法，通过间接免疫荧光法（IFA）检测，荧光显微镜判定结果，不仅特异而且易于判定。通过致病性试验发现可使小鼠10/10感染的最低病毒含量为106.5TCID50/0.1 mL。用该种毒攻击PCV2灭活疫苗免疫后的小鼠，通过病毒分离发现，当疫苗抗原病毒含量为105.0TCID50/0.1 mL时，可使小鼠5/10保护，而当疫苗抗原病毒含量为105.5TCID50/0.1 mL时，即可使小鼠7/10保护，达到疫苗质量标准的要求，说明所制备的疫苗具有较好的免疫效果，为疫苗生产工艺的改进提供了重要的数据参考。

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（编辑：张婷婷）

Immuno-efficacy of inactivated PCV2 vaccine inm ice

Zhu Guopo1,Li Shaol i1,Shao Panfeng1,Wang Binqing1,Li Xinhua1,2*
(1.Hangzhou Jianl iang Veterinary Biological Preparations Co.Ltd.,Zhej iang Hangzhou 310018; 2.Poult ry Institute,Chinese Academy of Agricul tural Sciences,Zhejiang Yangzhou 225125)

To evaluate the immune ef f icacy of porcine cirovirus type 2 vaccine,the viral isolation method was used to get the minimum content of PCV2 which can infect al l the Balb/c mice. Then,mice which had been immunized by inactivated vaccine were injected with this virus,and analyzed the protective ef fect.Resul ts showed that the minimum content of porcine circovirus type 2 can infect al l the Balb/c mice is 106.5TCID50/0.1 mL.The vaccine can protect the seven tenths of the mice with a viral content of 105.5TCID50/0.1 mL,and reach to the immune ef fect.The research could provide an impor tant reference data for improving the production process of existing vaccine.

Porcine circovirus type 2;Viral isolation;Vaccine

S858.28

：B

：1672-9692(2014)10-0033-04

2014-08-05

朱国坡（1980-），男，硕士，兽医师，主要从事动物疫苗研发方面工作。