非小细胞肺癌相关lncRNA的研究进展

张亚琛 梁迪 靳晶 刘聪敏 贺宇彤

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，据世界卫生组织国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer, IARC）资料[1]显示，2012年全世界约有182万肺癌新发病例，居全部恶性肿瘤发病的第1位，且我国肺癌的发病和死亡也非常严峻[2-4]。非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的主要类型，占所有肺癌的80%左右[5]。NSCLC主要分为鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞肺癌和肉瘤样癌等，由于早期缺乏明显临床表现，发现较晚，肿瘤细胞已发生淋巴转移和远处转移，因此预后较差，5年生存率通常低于20%[6]，严重威胁着人类的生命健康。因此研究NSCLC发生、发展的机制，对NSCLC诊断和治疗至关重要。随着分子生物学技术的发展，长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）逐渐成为研究热点，为肿瘤的研究提供了新的方向。本文将对与NSCLC发生、诊断、治疗和预后相关的lncRNA研究进展做一阐述，以期为NSCLC的防治提供新思路。

1 lncRNA概述

LncRNA是非编码RNA的一个类型，由于转录长度超过200个核苷酸并且缺乏蛋白质编码能力而得名，在表观遗传学调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用[7,]。研究[9]发现lncRNA在多种肿瘤中异常表达，且表达失调的lncRNA可作为肿瘤促进或抑制因子。它们具有编码蛋白质基因上游启动子区、干扰下游基因的表达、介导染色质重构及组蛋白修饰、与转录因子结合、与特定蛋白质结合及作为小分子RNA的前体分子等多种复杂的调控机制[10,11]。大量关于NSCLC与lncRNA的研究显示，lncRNA可以影响多种信号通路，在NSCLC的形成和进展中起重要作用。

2 lncRNA与肺癌发病的关系

肺癌的发生与吸烟密切相关，特别是肺鳞癌的发生与吸烟极为密切，而我国是烟草消费大国，因吸烟导致的肺癌就占到了93.75%[12]。有研究者通过采用香烟烟雾提取物诱导人类支气管上皮细胞（human bronchial epithelial, HBE）发生癌变，研究结果发现，HBE中的结肠癌相关转录子1（colon cancer-associated transcript 1, CCAT1）和多梳组蛋白BMI1表达升高，且miR-218（肿瘤抑制因子）的表达水平降低。其潜在机制可能是，CCAT1降低了miR-218的表达水平，进而促进了BMI1的表达，影响了细胞周期和细胞转移能力[13]。该实验组进一步研究指出，致癌转录因子c-Myc可通过与CCAT1启动子区结合来激活CCAT1的表达，而CCAT1可通过绑定游离的miRNA let-7c促进c-Myc的表达，从而形成一个正反馈回路促进香烟烟雾提取物诱导细胞癌变过程[14]。

空气污染已成为我国严重的公共卫生问题，有研究表明，全球肺癌死亡病例中有12.8%归因与人类生产造成的空气污染[15]。宣威市是我国肺癌发病率较高的城市[16]，周光彪等[17]研究发现，在宣威市NSCLC患者肿瘤组织中有多种lncRNAs异常表达，其中lncRNA CAR intergenic 10（CAR10）的高表达尤为显著。进一步研究发现，煤炭燃烧产生的多环芳烃家族二苯并蒽可通过转录因子FoxF2促进CAR10在肺癌上皮细胞中的表达，高表达的CAR10与YB-1结合调节EGFR通路，从而促进细胞增殖、诱导肿瘤发生。在我国，与细颗粒物（PM2.5）污染相关的死亡人数占城市居民死亡的32%，死亡率为1.9‰[18]。Deng等[19]的研究结果表明，PM2.5暴露会引起细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）和自噬能力的升高，表达升高的ROS可激活lncRNA loc146880的表达，并进一步上调细胞的自噬能力，从而增强了肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。

职业暴露同样是NSCLC发生的重要危险因素，Zhou等[20]首次发现了母系表达基因3（maternally expressed gene 3, MEG3）与镍暴露导致的肺鳞癌有关。先前研究[21-24]表明，MEG3是一种肿瘤抑制因子，可通过多种途径抑制细胞增殖。该研究发现，镍暴露引起MEG3表达下调，其潜在机制可能是，镍暴露导致MEG3启动子区超甲基化和表达抑制，导致Akt/p70S6K/S6通路激活，从而引起人支气管上皮细胞的癌变。由此可见，lncRNA在环境有害物质暴露诱发的NSCLC发生中扮演着重要角色，对这些因素和通路的研究将有助于研究NSCLC发生的原因，为NSCLC的防治提供线索。

3 lncRNA的临床应用

3.1 与NSCLC诊断相关的lncRNA 虽然肺癌诊断技术在不断提高，但有学者指出仍有40%的NSCLC患者被诊断为局部进展期或晚期的肺癌，这些患者通常不能进行手术切除，预后较差[25]，因此急需探索有效、便捷、经济的诊断方法。近年来，对lncRNA的研究发现，lncRNA在NSCLC细胞中异常表达，与NSCLC的发生发展密切相关，且lncRNA具有稳定性、特异性和易获得性，表明lncRNA可能成为潜在的NSCLC生物诊断标记物。研究这些lncRNA在NSCLC组织、血液中的表达，有助于研发特异性诊断标志物，提高NSCLC患者的检出率。

3.1.1 lncRNA在组织中的研究 许多研究发现，肺癌组织中表达异常的lncRNA和肿瘤的发生发展密切相关。Su等[26]研究了基因lncRNA PRAL（P53调控相关性lncRNA）对肺癌的影响，研究发现PRAL在肺癌组织中的表达明显低于癌旁及正常组织，且P53的表达水平也显著降低。将PRAL转染到NCI-H929和A549细胞系后，会促进P53的转录，抑制肿瘤细胞的增殖。据报道位于3p25.3的基因linc00312表达与肿瘤大小呈负相关且与NSCLC发生发展密切相关，Zhu等[28]研究了linc00312在NSCLC中的作用[27]发现，linc00312在肿瘤组织中表达下调，且与体外实验研究结果一致。研究还发现HOXA5转录因子和linc00312的表达呈正相关，说明linc00312可能是通过激活HOXA5转录因子的表达在细胞增殖、组织生长中发挥重要作用。最近，尿路上皮癌相关基因1（urothelial carcinoma associated 1, UCA1）已被确认为一种致癌基因，认为表达失调的UCA1与肿瘤发生发展紧密相关。有研究[29]发现，UCA1在NSCLC组织中高表达，且沉默UCA1后会降低肿瘤细胞的增殖能力。因此，进一步研究NSCLC组织中这些异常表达的lncRNA，将有可能使其成为潜在的生物诊断标志物，为NSCLC的诊断提供新的指标。

3.1.2 lncRNA在血液中的研究 最近，循环长链非编码RNA成为肿瘤生物学标志物研究的焦点，研究认为其对癌症的诊断有非常重要的意义。Tang等[30]利用lncRNA芯片分析寻找血液中潜在的NSCLC生物标志物，发现了三种lncRNA（RP11-397D12.4, AC007403.1, ERICH1-AS1）表达均上调，且三种lncRNA的合并阳性预测值、阴性预测值分别为0.72和0.87，有望成为预测NSCLC发生的潜在生物标志物。同样，Hu等[31]研究发现三种循环lncRNA：SPRY4-IT1、ANRIL和NEAT1在肿瘤组织中的表达存在差异，ROC曲线分析其曲线下面积分别为0.603、0.798和0.693，此研究认为将三者结合到一起诊断效能将会大大提高，其灵敏度为82.8%，特异度为92.3%，曲线下面积（area under the curve,AUC）为0.876。可见，血液中异常表达的lncRNA可以进行NSCLC的诊断，且不同的lncRNA间具有相关性。此外，某些单一的lncRNA异常也有助于NSCLC的诊断，有研究发现lncRNA生长停滞特异性转录本5（growth arrest-specific transcript 5, GAS5）在肺癌组织中低表达，Liang等[32]研究发现在NSCLC患者的血浆中GAS5处于稳定状态且表达下调，其诊断灵敏度和特异度分别为82.2%和72.7%，AUC为0.909，确定了GAS5和NSCLC诊断的关系。Wang等[33]研究发现，UCA1在NSCLC患者的血浆中表达显著升高，且与肿瘤组织中的表达一致，AUC为0.886，因此，血浆UCA1同样可作为NSCLC诊断的潜在生物标志物，能提高NSCLC筛选效能。

3.2 与NSCLC治疗相关的lncRNA lncRNA在NSCLC发生发展中扮演重要角色，相应的分子靶向治疗也在不断发展中。与其他靶向治疗机制类似，lncRNA的靶向治疗包括沉默、阻断、破坏致癌性的lncRNA，或向特定细胞中转入抑癌性的lncRNA。lncRNA具有多功能性，这一特点使它在疾病治疗方面拥有巨大的应用潜力，随着对lncRNA在肺癌发生发展过程中认识的加深，其在NSCLC治疗中的应用将越来越广泛。

3.2.1 致癌lncRNAs 能促进细胞增殖、侵袭能力及转移过程，抑制细胞凋亡以促进肿瘤发生发展的lncRNA被称为致癌lncRNAs[10]。Yang[34]等发现lncRNA XLOC_008466在NSCLC患者中高表达。当抑制XLOC_008466表达后，会抑制细胞的增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡。研究指出，XLOC_008466的功能与ceRNA类似，可直接结合miR-874使其表达下调，而MMP2和XIAP作为miR-874的下游靶点，表达将会升高，即XLOC_008466是通过miR-874-MMP2/XIAP通路来影响细胞的增殖和侵袭能力，从而发挥致癌作用的。因此，靶向药物通过阻断、破坏XLOC_008466可降低肿瘤细胞的增殖、侵袭能力，起到治疗的作用。还有研究发现与癌旁和正常组织相比，lncRNA Gm15290在NSCLC组织中明显高表达。将Gm15290转染到NSCLC A549细胞系中后，过表达的Gm15290可促进细胞的增殖和侵袭能力，当敲低Gm15290后，肿瘤细胞的增殖、侵袭能力明显减弱，且可以促进细胞凋亡。RNA pull-down试验证实了Gm15290可直接与miR-615-5p相结合，通过抑制miR-615-5p的表达并增加miR-615-5p靶基因（IGF2、AKT2和SHMT2）的蛋白质表达水平来促进肿瘤细胞增殖。因此，有学者使用miR-615-5p的类似物抑制了Gm15290对肿瘤细胞增殖、侵袭的作用，所以Gm15290将有望成为NSCLC治疗的关键靶点[35]。肺腺癌转移相关转录子1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）可促进肿瘤细胞迁移、侵袭并肿瘤生长，在NSCLC发生发展中发挥重要作用。有学者利用小分子抑制剂组蛋白脱甲基酶JMJD1A与MALAT1基因启动子区相结合，抑制MALAT1的表达，从而抑制了肿瘤细胞迁移和侵袭能力[36]。据报道，抑癌基因失活在肿瘤发生发展中发挥重要作用，Zirong等[37]发现linc00473的高表达与抑癌基因LKB1在NSCLC中经常发生突变和失活有关。linc00473可作为LKB1失活导致的NSCLC的治疗靶点，为NSCLC的靶向治疗提供新的方向。

3.2.2 肿瘤抑制lncRNAs 能抑制肿瘤发生发展的lncRNA被称为肿瘤抑制lncRNAs，发现新的肿瘤抑制lncRNAs并阐释他们的功能是了解肿瘤启动潜在机制的重要过程，且对进一步研发新的治疗靶点非常重要。反胰岛素生长因子2（insulin growth factor 2 antisense, IGF2AS）被认为是Wilms肿瘤中的印迹基因，参与多种蛋白质的转录和翻译[38]。研究发现IGF2AS在NSCLC组织中低表达，且和患者的总生存期密切相关。体外肺癌细胞系功能试验结果提示，高表达的IGF2AS明显抑制了肿瘤细胞的迁移能力。研究还探索了与IGF2AS相关的信号通路，发现IGF2AS表达上调会抑制IGF2/VEGF/bFGF信号通路，从而抑制NSCLC的发生发展，这表明IGF2AS是一个理想的药物治疗靶点[39]。HOTAIR是一种具有反式转录调控作用的lncRNA，可负向调节染色体转录，重组染色质并促进肿瘤进展。有研究发现，溴结构域抑制剂I-BET151，可通过影响HOTAIR启动子，降低HOTAIR的表达水平，从而起到肿瘤抑制的作用[40]。此外，在Kruer等[41]研究MEG3的作用机制中发现，通过使用帕博西尼治疗A549 和 SK-MES-1肺癌细胞后可活化Rb通路，增加MEG3的表达，而MEG3是通过影响Rb通路显著降低肿瘤细胞的增殖能力，为肺癌的治疗提供了一个潜在的方法。由此可见抑制性的lncRNA在NSCLC治疗方面同样具有广泛的应用前景，但还需要进一步研究探索从而更好的应用于临床。

3.2.3 lncRNAs在放化疗中的作用 研究发现NSCLC患者中存在EGFR突变，这种突变对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）如埃罗替尼和吉非替尼敏感[42,43]，但是大约10%的患者在10个月-16个月内会出现耐药[44]。最近，有学者指出lncRNA在EGFR-TKIs耐药性中起重要作用。Ma等[45]的研究中发现，有多种lncRNA在EGFR-TKIs耐药的细胞中异常表达。其中在吉非替尼耐药的细胞系 PC9中发现5种异常表达的lncRNA，包括3种高表达的lncRNA（UCA1,NEAT1, CASC9）和2种低表达的lncRNA（EWAST1,linc00524）。进一步研究lncRNA在EGFR-TKIs耐药性中的机制发现，CASC9和EWAST1共表达基因参与了几个重要途径，其中包括调节细胞生长、凋亡和染色质组装等途径，进而影响细胞对药物的敏感性。肺腺癌是NSCLC的主要类型，对化疗药物有较高的耐药性[46]。Pan等[47]研究多西他赛耐药的肺腺癌患者发现，linc-ROR在多西他赛耐药的细胞系中表达升高，体内实验表明，linc-ROR表达下调会提高患者对多西他赛治疗的敏感性，抑制肿瘤细胞的侵袭和扩散。进一步研究表明，linc-ROR可能是通过miR-145/FSCN1来影响EMT过程，从而影响肺腺癌患者对多西他赛的耐药性。放疗是肺癌治疗的重要手段之一，研究证实某些lncRNA和放疗敏感性相关。Xue等[48]研究发现在NSCLC组织和细胞中GAS5表达下调、miR-135b表达上调。试验结果显示，高表达的GAS5和低表达的miR-135b可显著降低照射下的NSCLC细胞的存活率，提高放疗敏感性，同时可通过抑制肿瘤细胞增殖、侵袭能力来显著抑制肿瘤的发生。Chen等[16]利用小鼠肺癌模型研究发现，经放射治疗后lncRNA HOTAIR表达下调，导致β-连环蛋白信号传导改变，最终抑制肿瘤细胞增殖。综上所述，CASC9、linc00277、linc-ROR、GAS5和HOTAIR等lncRNA均与NSCLC的治疗相关，同时可也作为NSCLC放化疗耐药性治疗的靶点，为NSCLC的治疗提供新思路。

3.3 与NSCLC预后相关的lncRNA NSCLC患者由于早期缺乏特异的临床表现，发现时多已经处于晚期，甚至发生淋巴及远处转移，因此患者预后较差。如前文所述，多种lncRNA与肺癌的诊断和治疗相关，这有助于提高患者的预后。同时，相关的lncRNA也有望成为评估预后的重要因素。有研究发现SPRY4-IT1在NSCLC组织中表达明显降低，且SPRY4-IT1的表达水平和肿瘤大小（P=0.001）、病理分期（P＜0.001）、淋巴转移（P=0.003）密切相关，因此该研究指出SPRY4-IT1是NSCLC预后一个独立的危险因素（P=0.009）[49]。最新研究发现lncRNA NEAT1和 MALAT1在NSCLC组织中高表达，并可以通过Oct4的调节促进肿瘤发生发展，且高表达的Oct4、NEAT1和MALAT1和NSCLC患者的不良预后有关，其HR=2.78（95%CI: 1.21-6.42）[8]。Tang等[50]探讨lncRNA在肺腺癌中的表达和预后的关系发现，有5种lncRNA（CYP4F26P、RP11-108M12.3、RP11-38M8.1、RP11-54H7.4和ZNF503-AS1）和肺腺癌的预后有关，其中CYP4F26P、RP11-108M12.3、RP11-38M8.1、RP11-54H7.4在肺癌组织中高表达，ZNF503-AS1低表达，这5种lncRNA预测患者5年生存期的AUC可到达0.691。多因素Cox回归分析指出HR为1.928（95%CI: 1.04-3.58），说明这五种lncRNA是肺腺癌预后一个重要指标。此外，lncRNA H19表达水平可在一定程度上反映肿瘤的侵袭性和转移状态[51]；还有研究发现，肿瘤手术治疗后lncRNA XIST和HIF1A-AS1血清水平显着降低，可作为评价治疗效果的标志物[52]。所以，对这些lncRNA的研究有利于评估NSCLC患者的预后，并为改善预后提供新的研究方向。

4 结语

近年来，肺癌的发病和死亡在不断增加，关于肺癌机制的研究也在不断进行中，随着深度测序、基因芯片、实时定量PCR检测和原位杂交等技术的快速发展和应用，相关lncRNA的研究也在不断深入，其在肺癌发生发展中的作用也备受关注。lncRNA在环境有害物质暴露诱发的NSCLC中发挥重要作用。据报道，CCAT1、CAR10、MEG3等lncRNA都会诱发支气管上皮细胞恶变，形成肿瘤。先前的研究已经证明多种lncRNAs在NSCLC组织和血液中异常表达，可以作为NSCLC诊断的标志物。不同于miRNA，lncRNA的表达水平能更好地反映疾病状态；同时，lncRNA的表达模式高度特异，提示其表达状态可以被用于疾病的诊断或分类。其中UCA1作为肿瘤发生发展的重要因子，在肿瘤组织和血液中的表达异常，使其有望成为有效的NSCLC诊断标志物，但在组织和血液中表达的稳定性和有效性还有待进一步研究。另外，不同种类的lncRNA也可作为NSCLC预后的标志物。通过研究lncRNA的异常表达，不仅可以评估患者肿瘤的转移情况，还可以评估患者治疗效果，从而综合评价患者预后。由此可见，研究这些lncRNA为NSCLC的诊断和预后提供了新的研究方向。

随着治疗手段的不断发展，靶向治疗成为癌症的有效治疗方法，lncRNA在靶向治疗中发挥重要的作用。如今，越来越多的lncRNA不断被发现，其中有致癌性lncRNA，如XLOC_008466、Gm15290、linc00473等，它们的过表达可促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，促进肿瘤的进展，也有抑制性lncRNA，IGF2AS、MEG3、HOTAIR。此外，lncRNA的遗传多态性与化疗敏感性有关，也可作为肺癌患者预处理评估的生物标志物，改善化疗效果[53]。这些lncRNA不仅有望成为治疗药物的有效靶点，还在放化疗敏感性中发挥重要作用。研究这些lncRNA，了解他们在NSCLC发生发展中的机制，从而对NSCLC患者进行有效的治疗。随着抗肿瘤药物研发不断深入，对小分子化合物的研究已有所进展，为靶向治疗来了广阔的发展前景。但是，因为有关lncRNA的靶向治疗研究有限，尤其在临床应用方面，所以一方面需要进一步明确lncRNA的作用机制，探索更有效的靶点；另一方面需要探索lncRNA与肺癌传统治疗的关系及相互作用机制，为NSCLC的治疗提供新思路、新方法。