Amorphigenin联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞的协同抗肿瘤作用

钟红珍 左瑜芳 巫鑫 彭艳 何会萍 杨俊 官成浓 徐祖敏

目前肺癌发病率、死亡率居首位[1]。临床上通常将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌占85%[2]。而肺癌的化学治疗主要采用顺铂联合吉西他滨、紫杉醇等当中的一种[3]。虽然化疗在肺癌的治疗中取得了一定的进展，但5年总生存率仍较差，低于16%[4]。顺铂耐药是影响肺癌化疗疗效的重要因素之一。因此，克服肺癌对顺铂的耐药具有重要的意义。Amorphigenin是从紫穗槐的种子中提取得到的一种鱼藤酮类化合物[5]。研究[6-8]发现amorphigenin有多种生物活性，如抗增殖作用、护肝作用、抑制神经氨酸酶的作用及抑制肺癌、结肠癌、黑色素瘤、口腔癌，白血病、前列腺癌、乳腺癌等细胞的生长。虽然amorphigenin可抑制人肺腺癌细胞A549[7]和人肺癌细胞Lu-1[8]的生长，但amorphigenin对耐顺铂肺腺癌A549/DDP细胞的作用及抗肿瘤作用的机制目前在国内外尚未见报道。本研究的目的是研究amorphigenin对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的抗肿瘤作用并探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Amorphigenin由广东医科大学天然药物研究与开发重点实验室提供，纯度＞95%[5]。顺铂购于江苏豪森药业股份有限公司，二甲亚砜（DMSO）从美国MP Biomedicals LLC公司购买，RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）购买于美国Gibco公司，胰酶购于吉诺生物医药技术有限公司，碘化丙锭（PI）和FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒购自于美国BD公司，兔抗人PARP、caspase-3、LRP抗体购买于Sigma公司。辣根酶标记的山羊抗兔IgG、鼠抗人GAPDH多克隆抗体均购买于碧云天公司。Amorphigenin用DMSO溶解，配制成50 μmol/L的储存液，-20 ℃冰箱贮存。实验前用RPMI-1640培养基稀释，将DMSO的终浓度控制在＜0.1%。

1.2 细胞培养 人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP和A549细胞由本实验室保存并常规传代培养，培养于含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）的RPMI-1640培养基中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养。细胞每2天-3天常规传代一次，所有实验的细胞均使用对数生长期的细胞。

1.3 CCK-8法测定细胞活力 取对数生长期的细胞，常规胰酶消化成单个细胞悬液，按5.0×103个细胞/孔的密度种于96孔板中，置于培养箱中孵育过夜后，分别加入终浓度为0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的amorphigenin或终浓度为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的顺铂。于培养箱培养24 h、48 h后，弃去原来的培养液，然后每孔加入按说明书新配制的100 μL CCK-8试剂，再于培养箱孵育2 h后，用酶标仪于450 nm波长处测吸光值。按照下列公式计算药物对细胞的存活率：存活率%=实验组吸光值/对照组吸光值×100，并计算48 h的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。

1.4 克隆形成实验 取对数生长期的细胞，消化成单个细胞悬浮液，500个细胞/孔接种于6 cm培养皿中，待细胞生长稳定时，加入终浓度为0.062,5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L的amorphigenin，空白对照组加入等量的培养基。放置培养箱培养15 d，当形成肉眼可见的细胞克隆后终止培养，用PBS洗2次，再用甲醇固定，然后用结晶紫染色，洗净晾干，在显微镜下拍照计数。克隆形成率%=（实验组克隆数/对照组克隆数）×100%。

1.5 联合指数计算 我们使用Chou-Talalay方法研究药物组合的协同的可能性[9]。取对数生长期的细胞，常规胰酶消化成单个细胞悬液，按5.0×103个细胞/孔的密度种于96孔板中，置于培养箱中孵育过夜后，除去原来的培养基；先用浓度为0.5 μmol/L、1 μmol/L的amorphigenin处理人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP 24 h后；再用浓度为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的顺铂处理24 h；弃去原来的培养液，然后每孔加入按说明书新配制的100 μL CCK8试剂，再于培养箱孵育2 h后，用酶标仪于450 nm波长处测吸光值。按照下列公式计算细胞的存活率：存活率%=实验组吸光值/对照组吸光值×100。使用CompuSyn软件自动计算出两药的联合指数及描绘出两药等效图，在等效图中（D1/Dx1）为横坐标，（D2/Dx2）为纵坐标，D1、D2为两药合用产生x效应时两药各种所需的浓度，而Dx1、Dx2则为两药单独使用时产生x效应时两药各自的浓度；根据Chou-Talalay定理规定CI＜1则两药联合为协同作用，CI=1则为相加作用，CI＞1，则为拮抗[10]。

1.6 细胞凋亡测定 取对数生长期的细胞，消化成单个细胞悬液，8×103个细胞/ 孔，接种于6孔板，置于培养箱孵育过夜，加入终浓度为0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的amorphigenin，联合组amorphigenin浓度为0.5 μmol/L和顺铂浓度为10 μg/mL，处理48 h后，消化收集细胞，用PI和FITC Annexin V染色，以流式细胞术检测细胞凋亡率，未处理组细胞为对照组。

1.7 免疫印迹实验 取对数生长期的细胞，以2×105个/孔的密度接种于6 cm培养皿中，孵育过夜后按以下方法加入药物：amorphigenin组（0.5 μmol/L)、顺铂组（10 μg/mL)、amorphigenin联合顺铂组，处理48 h后，提取细胞总蛋白，经BCA法测定蛋白浓度，取12 μg总蛋白上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)，再转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗于4 ℃冰箱孵育过夜，辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1h，洗膜后辣根过氧化物酶HRP-ECL发光显色法对膜进行显色曝光。

1.8 统计学方法 数据采用GraphPad Prism 5软件进行单因素方差分析或t检验，所有数据均为3次独立实验结果，以Mean±SD表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Amorphigenin对人肺腺癌细胞株A549及耐顺铂株A549/DDP的生长抑制作用 CCK-8结果显示顺铂能抑制A549/DDP和A549细胞的生长，A549/DDP的48 h的IC50为（16.91±1.60）μmol/L，而A549的48 h的IC50为（2.84±0.18）μmol/L，A549/DDP的耐药倍数约为9.7倍（图1A），表明A549/DDP对顺铂具有明显的耐药性。此外，amorphigenin呈浓度依赖性地抑制耐顺铂株A549/DDP的生长（图1B），其48 h的IC50为（2.19±0.92）μmol/L。这些结果表明amorphigenin对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP有明显的增殖抑制作用。

2.2 Amorphigenin抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的克隆形成 分别用0.062,5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L的amorphigenin处理人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP 15 d，形成的克隆数目随浓度增加而逐渐减少（图2A）。统计学分析发现0.062,5 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L的amorphigenin作用于A549/DDP细胞时，克隆形成率分别为（84.31±4.46）%、（42.49±8.65）%和（9.94±5.89）%（图2B）。这提示amorphigenin能以浓度依赖方式抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的克隆形成。

图1 Amorphigenin对肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的增殖抑制作用。A：不同浓度的顺铂作用于A549细胞和A549/DDP细胞48 h；B：Amorphigenin作用于A549/DDP细胞24 h或者48 h。**：P＜0.01，与对照组比较。Fig 1 Amorphigenin could significantly inhibit the proliferation in cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma A549/DDP cells.A: A549 and A549/DDP cells were treated with increasing concentrations of cisplatin for 48 h; B: A549/DDP was treated with increasing concentrations of amorphigenin for 24 h or 48 h.**: P＜0.01, compared with the control group.

图2 Amorphigenin抑制肺腺癌耐顺铂细胞A549/DDP的克隆形成。A：细胞培养15天后，用结晶紫染色。B：在显微镜下统计细胞克隆数目。*：P＜0.05，**：P＜0.01，与对照组比较。Fig 2 Amorphigenin inhibits the colony formation of cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma A549/DDP cells.A: Colonies were stained with crystal violet at 15 days after culture; B: The number of colonies was counted under microscope.*: P＜0.05, **: P＜0.01,compared with the control group.

2.3 Amorphigenin诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP凋亡 我们采用了流式细胞术检测了amorphigenin处理后A549/DDP细胞的凋亡率。用0.5 μmol/L-16 μmol/L浓度的amorphigenin处理人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP 48 h，采用PI和FITC Annexin V双染法及流式细胞术检测了细胞的凋亡率，结果显示amorphigenin呈浓度依赖性地诱导A549/DDP细胞的凋亡，当amorphihenin浓度为0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L时，凋亡率分别为（7.50±1.70）%、（9.20±0.56）%、（13.13±2.24）%、（13.7±4.62）%、（28.93±8.17）%和（69.53±10.52）%（图3A，图3B）。为了更进一步说明凋亡途径的激活可能与amorphigenin诱导的细胞凋亡有关，我们采用免疫印迹技术检测了凋亡相关蛋白PARP的表达。结果发现，随着amorphigenin浓度的升高，PARP的蛋白表达水平逐渐减少，而cleaved PARP的蛋白表达水平逐渐增加，提示amorphigenin可能是通过激活PARP通路从而诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞凋亡（图3C，图3D）。这些结果证明了amorphigenin能诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP凋亡。

图3 Amorphigenin诱导肺腺癌细胞株A549/DDP凋亡。A、B：Amorphigenin处理A549/DDP细胞48 h；C、D：Amorphigenin对PARP和cleaved PARP蛋白的影响。*：P＜0.05，**：P＜0.01，与对照组比较。Fig 3 Amorphigenin could induce apoptosis in A549/DDP cells.A and B: A549/DDP cells were treated with increasing concentrations of amorphigenin for 48 h; C and D: The levels of PARP and cleaved PARP.*: P＜0.05，**: P＜0.01, compared with the control group.

2.4 Amorphigenin联合顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP具有协同的抗肿瘤作用 我们先用浓度为0.5 μmol/L、1 μmol/L的amorphigenin处理人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP 24 h后，再用浓度为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的顺铂处理24 h，然后采用CCK-8法检测细胞的增殖变化。结果发现顺铂与0.5 μmol/L、1 μmol/L的amorphigenin联合处理后，顺铂的24 h的IC50分别为（15.86±2.91）μg/mL、（5.18±1.94）μg/mL，较单独应用顺铂时（37.99±10.63）μg/mL明显减低（图4）。这表明amorphigenin能增强顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的生长抑制作用。且根据等效线图分析示: Amorphigenin和顺铂10个组合浓度中，9个组合的浓度的CI＜1，1个组合浓度CI＞1；具体CI值：当浓度为0.50 μmol/L的amorphigenin联合2.5 μg/mL的顺铂时CI为1.31，提示拮抗作用；0.50 μmol/L的amorphigenin联合5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的顺铂时CI分别为0.97、0.77、0.75、0.82，提示是协同作用；同样浓度为1.00 μmol/L的amorphigenin联合5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的顺铂时CI分别为0.60、0.52、0.58、0.60、0.66，提示是协同作用（图5A， 图5B）。这提示两药联合呈协同作用。

2.5 Amorphigenin增强顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的凋亡作用 我们采用流式细胞术测定了两药联合时对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP凋亡的作用，单用amorphigenin时凋亡率为（10.40±1.77）%，单用顺铂时凋亡率为（43.90±6.22）%，两药联合时凋亡率则达到（75.27±8.29）%（图6A， 图6B）。此外我们还采用了免疫印迹技术检测caspase-3、PARP蛋白表达。结果发现，amorphigenin联合顺铂与单用amorphigenin或顺铂相比，pro-caspase-3、PARP的蛋白表达明显减少，cleaved PARP和cleaved caspase-3的蛋白表达明显增加（图6C-图6F）。总之，amorphigenin增强顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的凋亡作用。

图4 Amorphigenin联合顺铂增强对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的增殖抑制作用Fig 4 Combination of amorphigenin with cisplatin enhances the inhibition effects on cisplatin-resistant lung cancer cells

图5 Amorphigenin联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞的协同抗肿瘤作用。浓度为0.5 μmol/L（A）和1 μmol/L（B）的amorphigenin联合浓度为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL的顺铂的CI值。根据Chou-Talalay定理规定CI＜1则两药联合为协同作用，CI=1则为相加作用，CI＞1，则为拮抗。Fig 5 Synergistic antitumor effect of amorphigenin combined wih cisplatin in human lung adenocarcinoma cell A549/DDP.CI values for amorphigenin at 0.5 μmol/L (A) and 1 μmol/L (B) in combination with 2.5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL cisplatin against A549/DDP cells.CI is a quantitative definition for synergism where CI＜1, additive effect where CI=1 and antagonism where CI＞1.

图6 Amorphigenin增强顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的凋亡作用。A、B：分别用amorphigenin或/和顺铂处理A549/DDP细胞48 h；C、E和G：Caspase-3、PARP和LRP的Western blot检测结果； D、F和H：Caspase-3、PARP和LRP含量变化的柱状分析图。*：P＜0.05，**：P＜0.01，与对照组比较。Fig 6 Combination of amorphigenin with cisplatin enhances the antitumor effects on A549/DDP cells.A and B: A549/DDP cells were treated with amorphigenin or cisplatin alone or combined with amorphigenin (0.5 μmol/L) and cisplatin (10 μg/mL) for 48 h; C, E and G: The expression of caspase-3, PARP and LRP detected by Western blot; D, F and H: The densitometric analysis of caspase-3、PARP and LRP.**: P＜0.01, compared with the control group.

2.6 Amorphigenin降低LRP蛋白的表达 分别用amorphigenin，顺铂或amorphigenin联合顺铂处理A549/DDP细胞48 h，采用免疫印迹技术检测LRP蛋白的表达。我们的结果发现，amorphigenin联合顺铂与单用amorphigenin或顺铂相比，LRP蛋白的表达明显减少，而单用顺铂组或amorphigenin组与对照组比较相差不大（图6G和图6 H）。这提示了amorphigenin通过下调LRP蛋白的表达联合顺铂对肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的协同抗肿瘤作用。

3 讨论

Amorphigenin是一种鱼藤酮类化合物糖苷类紫穗槐苷的糖基苷元，早期的研究[11-13]发现其具有抑制破骨细胞的分化和溶解、保护肝脏、抑制细菌神经氨酸苷酶的作用。进一步的研究发现，amorphigenin可抑制多种肿瘤细胞的增殖作用，如肺腺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT-8、黑色素瘤细胞RPMI-7951、人乙酰胆碱受体细胞TE671、人口腔表皮样癌细胞KB、鼠白血病细胞P388，它们的半数有效量（50% effective dose, ED50）分别为0.05 μg/mL、0.03 μg/mL、0.05 μg/mL、＜0.01 μg/mL、0.04 μg/mL、0.04 μg/mL[7]。人肺癌细胞Lu-1、人激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP、人乳腺癌细胞MCF-7，其ED50分别为4.8 μg/mL、7.9 μg/mL和＞20 μg/mL[8]。而我们的研究首次发现amorphigenin以浓度依赖性方式抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞的生长，其48 h的IC50为（2.19±0.92）μmol/L，并且诱导A549/DDP细胞凋亡。进一步研究的发现amorphigenin诱导人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞凋亡的机制可能是通过激活PARP途径。

为了明确amorphigenin能否联合顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP有协同的抗肿瘤作用。结果发现顺铂与amorphigenin联合处理后，amorphigenin能显著增强顺铂对A549/DDP的生长抑制作用，且amorphigenin能增加顺铂对人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的凋亡率。进一步的研究发现，与amorphigenin或顺铂处理组相比，amorphigenin联合顺铂组pro-caspase-3、PARP蛋白的表达明显降低，而cleaved caspase-3和cleaved PARP蛋白表达明显增加，提示amorphigenin可能通过激活caspase-3、PARP蛋白从而诱导细胞凋亡。

目前的研究认为肺癌顺铂耐药机制主要是以下几个方面：①细胞内药物浓度下降；②细胞解毒功能增强；③DNA损伤修复功能异常；④逃避细胞凋亡[14]。细胞内药物浓度下降主要与药物耐药蛋白相关；一些报道的耐药蛋白有肺耐药蛋白（lung resistance protein, LRP）、乳腺癌耐药蛋白（breast cncaer resistance protein, BCRP）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein,MRP）；此外，切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-completion 1,ERCC1）与顺铂的耐药也密切相关。MRP，是一个ATP依赖的膜运输蛋白，当抗肿瘤药物进入肿瘤细胞时，MRP使用ATP水解的能量把药物泵出细胞，从而减少细胞内的药物浓度增加药物的耐药性。LRP又叫主穹窿蛋白，主要参与细胞内毒性药物的分布而增加耐药，多项研究[15,16]表明肺LRP的高表达会导致对顺铂的耐药。ERCC1、DNA修复核酸内切酶，具有5′DNA核酸内切酶活性，在DNA切除修复过程中能够识别和清除铂类药物诱导的DNA络合物，从而导致对顺铂的耐药。BCRP，属于ABC膜转运蛋白超家族成员，也是依赖ATP将化疗药物泵出细胞，降低细胞内药物浓度，从而增加药物的耐药性[17]。Gyemant等[18]研究发现amorphigenin通过降低MDR的表达水平来抑制多药耐药的人乳腺癌细胞HTB-26和多药耐药的小鼠淋巴瘤细胞L5178Y的细胞增殖，并且amorphigenin联合表柔比星对多药耐药的小鼠淋巴瘤细胞L5178Y有协同的抗肿瘤作用。而amorphigenin对其他肿瘤的作用机制目前国内外均未见报道。但我们的研究首次发现amorphigenin通过降低LRP蛋白表达的水平来抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的生长，并且amorphigenin联合顺铂对A549/DDP细胞有协同的抗肿瘤作用。本研究我们发现amorphigenin可通过诱导凋亡抑制A549/DDP细胞增殖及增强顺铂对A549/DDP细胞的生长抑制作用。且amorphigenin可通过下调LRP蛋白表达的水平来抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的生长。然而，amorphigenin能否通过影响其他耐药蛋白和/或DNA损伤修复等信号通路，仍需进一步的探索。

总之，本研究发现amorphigenin可通过诱导细胞凋亡抑制人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP的生长。Amorphigenin可能是通过抑制耐药蛋白LRP蛋白表达，进而与顺铂对A549/DDP细胞产生协同抗肿瘤作用，这为amorphigenin用于顺铂耐药肺癌的治疗提供了科学依据及理论基础。