ID1对非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药的影响

鲍昱辰 赵印敏 陈斌 罗洁 邓沁芳 孙辉 谢博雄 周崧雯

肺癌的发病率和死亡率很高，严重威胁人类健康[1,2]。在我国城市中肺癌死亡率已上升为第一位[3]。随着分子生物学的研究进展，靶向药已成为治疗非小细胞肺癌的重要手段[4]。然而，即使对于敏感人群，第一代表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI）（包括易瑞沙、特罗凯、凯美纳）或早或晚仍会出现获得性耐药，导致疾病进展[5,6]，因此，如何克服耐药提高疗效已成为靶向药治疗的重要瓶颈[7,8]。分化抑制因子（differentiation inhibitory factor, ID）是一种负性调节因子[9,10]。近年的研究表明，ID蛋白在肿瘤发生及发展过程中发挥了重要作用[11]。ID1作为ID蛋白家族成员，在多种肿瘤中呈高表达，是一种潜在的癌基因[12,13]。有研究[14,15]认为ID1与肺癌靶向药耐药相关，但相关报道甚少，具体分子机制未明。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 肺腺癌细胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R由上海市肺科医院中心试验室提供。其中PC-9为EGFR-TKI敏感株，PC-9R为EGFR-TKI获得性耐药株，H1975为T790M突变EGFR-TKI耐药株，A549、H522为EGFR-TKI原发耐药株，获取我院肺癌手术患者癌组织及癌旁组织。青霉素、链霉素购自上海先锋药业公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；SYBR Green PCR试剂盒购自TAKARA公司；RNaseI购自Fermentas公司；兔抗人单克隆抗体购自Abcam公司；BSA购自北京索莱宝生物科技有限公司；吉非替尼购自大连美仑；Realtime检测仪购自ABI公司；流式细胞仪购自Backman Coulter公司。

1.2 细胞培养 H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R细胞用10%DMEM含双抗培养液在细胞恒温培养箱（温度为37 ℃且含5%CO2）中培养，次日换液。培养基为90%EMEM，10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA消化传代，所有试验均采用对数生长期细胞。

1.3 ID1 siRNA慢病毒载体及ID1过表达慢病毒载体的构建ID1 siRNA慢病毒载体构建：shRNA序列：5’-CATGAACGGCTGTTACTCA-3’；病毒滴度：8×108U/mL，同时构建阴性对照慢病毒，ID1过表达慢病毒载体的构建：ID1基因片段引物：上游5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAAAGTCGCCAGTGGCAG-3’；下游5’-TCCTTGTAGTCCATACCGCGACACAAGATGCGATC-3’。病毒滴度：2×108U/mL，同时构建阴性对照慢病毒。胰酶消化各组肺腺癌细胞，制成细胞悬液；显微镜下数出细胞总数，荧光显微镜观察荧光表达情况。

1.4 MTT法检测细胞增殖 细胞计数，调整细胞浓度，每孔悬液约100 μL，以5,000个/孔接种到96孔细胞培养板中，37 ℃、CO2培养24 h；弃培养基，加入含不同浓度吉非替尼（0 μmol/L、0.01 μmol/L、0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L）的培养基继续培养72 h；每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃培养4 h；吸去上清液，加入200 μL二甲基亚砜（DMSO），使结晶物充分溶解；采用酶标仪检测570 nm的吸光度（A）值，每组设4个复孔；按以下公式计算细胞增殖率：［（空白组吸光度平均值-DMSO空白组平均值）-（各组平均值-DMSO空白组平均值）］/（空白组平均值-DMSO空白组平均值） ×100%=抑制率；采用直线回归方法计算药物的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）值，实验重复3次。

1.5 Real-Time PCR检测各组肿瘤细胞ID1 mRNA的表达情况 去对数生长的各组肺腺癌细胞，Trizol法提取RNA，逆转录制备cDNA。将制备好的cDNA进行PCR扩增，ID1上游引物序列：5’-AAACGTGCTGCTCTACGACA-3’，ID1下游引物序列：5’-GGAACGCATGCCGCCT-3’，GAPDH上游引物序列：5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，GAPDH下游引物序列：5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’；95 ℃变性10 min后，按下述条件扩增40个循环，95 ℃，15 s；60 ℃，45 s；60 ℃延伸1 min。

1.6 免疫组化检测ID1蛋白的表达 选取标本经10%甲醛固定后，常规石蜡包埋、切片，厚度4 μm。采用免疫组化SP法，用PBS液代替一抗作为阴性对照，按照试剂说明书进行操作。结果判断：所有切片均采用双盲法由两位病理科医师独立阅片。ID1阳性表达均定位于细胞浆和细胞膜，呈浅黄色、黄色或棕黄色。随机选择10个高倍镜视野（400倍），每个视野连续计数100个细胞，共计数1,000个细胞。最后表达以染色强度和阳性细胞率的得分之和进行判断：无染色记0分，弱染色记1分，中等染色记2分，强染色记3分；阳性细胞率＜5%记0分，5%-25%记1分，26%-50%记2分，＞50%记3分。上述两项评分相加，＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.7 Western blot检测相关蛋白的表达 取对数生长期的经siRNA慢病毒载体及ID1过表达慢病毒载体转染的H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R细胞，收集细胞裂解提取蛋白。BCA法测定细胞裂解物的蛋白含量，取等量蛋白质以12% SDS-PAGE法分离并转移至PVDF膜上，以单克隆抗体4 ℃过夜孵育以检测目标蛋白（p-ERK、ERK、p-AKT、AKT、p-STAT3、STAT3、p-EGFR、EGFR），GAPDH作为内参。洗去一抗，以HRP连接的二抗于室温孵育2 h，洗涤后以ECL试剂盒显示免疫印迹条带。

1.8 动物实验 将肺腺癌细胞PC-9、PC-9/ID1-OE、PC-9/R、PC-9/R/ID1-KD细胞接种至75 cm2细胞培养瓶中，待细胞扩增至90%，胰酶消化，接种至BALB/c-nu裸鼠腋下；每只接种1×108个细胞。每株肺腺癌实验动物各设空白对照和吉非替尼两组。待肿瘤直径生长至3 mm左右时，空白对照组使用生理盐水灌胃治疗，吉非替尼组使用吉非替尼灌胃治疗（剂量为2 mg/kg/d），每天灌胃一次，持续4周；4周后，颈椎脱臼法处死，剥离肿瘤组织，测量肿瘤大小。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，所有数据均以Meab±SD表示，单变量两组间资料比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ID1在肺癌细胞株中高表达 肺癌细胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R中的ID1 mRNA均有表达（图1）。肺癌组织ID1 mRNA的表达比癌旁组织中高，有统计学差异（P＜0.05）（图2A）。肺癌组织ID1蛋白的表达比癌旁组织中表达高，有统计学差异（P＜0.05）（图2B）。

2.2 ID1与肺癌耐靶向药的关系 PC-9R细胞中ID1 mRNA表达量高于PC-9细胞，且具有统计学意义（P＜0.05）（图1，图3）。根据荧光定量PCR的实验结果，选择PC-9细胞株感染ID1过表达慢病毒载体（ID1-OE），H522、H1975、A549、PC-9R细胞株感染ID1干扰慢病毒载体。72 h后用荧光显微镜观察，各组病毒感染率均大于90%，符合后续实验要求。MTT法检测吉非替尼对各组细胞增殖抑制作用。实验结果显示PC-9细胞感染ID1过表达慢病毒后，对吉非替尼的IC50值为0.64 μmol/L，较对照组（0.05 μmol/L）有一定程度的上升。PC-9R细胞感染ID1干扰慢病毒后，对吉非替尼的IC50值为1.14 μmol/L，较对照组（5.05 μmol/L）有一定程度的下降（表1）。而A549、H522、H1975细胞在感染ID1干扰慢病毒后，对吉非替尼的IC50值无明显改变。

2.3 各组细胞株在感染ID1干扰慢病毒后，ID1的表达情况 慢病毒感染后，H522、H1975、PC-9R、A549细胞中ID1表达下降，PC-9细胞中ID1表达上升（图4）。ID1-siRNA慢病毒感染PC-9R后，p-ERK、p-AKT、p-STAT3、p-EGFR有不同程度下降，ERK、AKT、STAT3、EGFR无明显改变；吉非替尼处理后，ID1-siRNA组ERK、AKT、EGFR磷酸化程度较对照组明显降低。ID1-OE慢病毒感染PC-9后，磷酸及非磷酸ERK、AKT、STAT3、EGFR均无明显改变；吉非替尼处理后，PC-9-ID1-OE组AKT、STAT3磷酸化程度较对照组有一定程度升高（图5）。

2.4 动物实验结果 PC-9实验组肿瘤平均体积为50.8 mm3，对照组肿瘤平均体积3,283.6 mm3，肿瘤抑制率为98.5%；PC-9（ID1 OE）实验组肿瘤平均体积为465.5 mm3，对照组肿瘤平均体积为1,084.7 mm3，肿瘤抑制率为57.1%，组间存在统计学差异（表2）。PC-9/R实验组肿瘤平均体积为81.2 mm3，PC-9/R对照组肿瘤平均体积为371.8 mm3（图5A），肿瘤抑制率为78.2%；PC-9/R（ID1 siRNA）实验组肿瘤平均体积为0，对照组肿瘤平均体积为85.3 mm3（图5B），肿瘤抑制率为100%，组间存在统计学差异（表2），值得注意的是，ID1基因沉默后，PC-9/R肿瘤生长极为缓慢，28 d仅增长0.9倍。

3 讨论

本研究证实了ID1参与非小细胞肺癌对EGFR-TKI耐药，且与手术患者预后相关。在探讨ID1是否参与肺癌靶向药耐药的相关研究中，我们检测了PC9及PC-9/R、H1975、A549、H522多组肺癌细胞株中ID1 mRNA。发现PC-9细胞中ID1 mRNA相对表达量较低，而PC-9/R细胞则明显升高，说明ID1与肺癌EGFR-TKI耐药相关。同时，发现H1975、A549、H522多组肺癌细胞株中ID1高表达，故对非小细胞肺癌手术标本免疫组化及RT-PCR检测，提示ID1在肺癌组织中较正常组织明显升高（P＜0.05）；分层分析显示，病理类型对ID1表达有意义，在鳞癌患者中呈高表达；分期及性别与ID1表达无相关性；1年OS与ID1表达分析提示，ID1与肺癌预后相关。进一步探讨ID1与非小细胞肺癌对EGFR-TKI耐药的相关性：使用慢病毒干扰技术，过表达及沉默肺癌细胞株ID基因的表达，再检测ID1蛋白的表达变化。结果显示：PC-9细胞感染ID1过表达慢病毒后，对吉非替尼的IC50值为0.64 μmol/L，较对照组（0.05 μmol/L）有一定程度的上升，说明PC-9敏感性降低；PC-9/R细胞感染ID1干扰慢病毒后，对吉非替尼的IC50值为1.14 μmol/L，较对照组（5.05 μmol/L）有一定程度的下降，说明PC-9/R耐药性降低（表1）。荷瘤裸鼠实验结果：PC-9 ID1-OE吉非替尼用药组肿瘤体积大于PC-9吉非替尼用药组。同时发现，吉非替尼处理后，ID1-siRNA组ERK、AKT、EGFR磷酸化程度较对照组明显降低，ID1-OE组AKT、STAT3磷酸化程度较对照组有一定程度升高。这说明：ID1表达量与肺癌EGFR-TKI耐药性呈正相关；STAT3可能通过磷酸化机制参与EGFR-TKI耐药。有研究[16]发现，STAT3的siRNA或抑制剂通过抑制STAT3激活，增强了肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。但目前STAT3介导吉非替尼耐药的机制还不是很明确，需要进一步研究。

图1 肺癌细胞株H522、H1975、A549、PC-9、PC-9R中的ID1 mRNA相对表达量（P＜0.05）Fig 1 Relative expression of ID1 mRNA in H522, H1975, A549, PC-9 and PC-9R lung cancer cell lines (P＜0.05)

图2 ID1在肺癌组织与癌旁组织的相对表达量（P＜0.05）。A：肺癌组织ID1 mRNA的表达量比癌旁组织中ID1 mRNA的表达量高（P＜0.05）；B：肺癌组织ID1蛋白的表达比癌旁组织中ID1蛋白的表达高（P＜0.05）。Fig 2 Relative expression of ID1 in lung cancer tissues and adjacent tissues.A: The expression of ID1 mRNA in lung cancer tissues is relatively higher than that in adjacent tissues (P＜0.05); B, C: The expression of ID1 protein in lung cancer tissues is higher than that in adjacent tissues(P＜0.05).iOD: integral optical density.

图3 PC-9R细胞中ID1 mRNA表达量高于PC-9细胞（P＜0.05）。Fig 3 The expression of ID1 mRNA in PC-9/R cell lines is higher than that in PC-9 cell lines (P＜0.05).

本研究通过体内外实验从细胞、动物到临床标本深入探讨了ID1与肺癌之间的关系，证实ID1在肺癌组织中高表达，其中以腺癌尤为明显，且ID1参与非小细胞肺癌对EGFR-TKI的获得性耐药。ID1或可成为非小细胞肺癌有价值的检测项目[17]；ID1参与肺癌对EGFR-TKI的耐药，可能与STAT3的磷酸化有关，具体机制还有待我们接下来更深入地研究[17]。

图4 慢病毒感染后，各组细胞ID1的表达情况以及PC-9R中不同信号通路的酶表达情况。A：慢病毒感染后，H522、H1975、PC-9R、A549细胞中ID1表达下降，PC-9细胞中ID1表达上升；B：ID1-siRNA慢病毒感染PC-9R后，p-ERK、p-AKT、p-STAT3、p-EGFR有不同程度下降，ERK、AKT、STAT3、EGFR无明显改变；吉非替尼处理后，ID1-siRNA组ERK、AKT、EGFR磷酸化程度较对照组明显降低。ID1-OE慢病毒感染PC-9后，磷酸及非磷酸ERK、AKT、STAT3、EGFR均无明显改变；吉非替尼处理后，PC-9-ID1-OE组AKT、STAT3磷酸化程度较对照组有一定程度升高。Fig 4 After slow viral infection, groups of cells expressed the ID1 enzyme in different signaling pathways of PC-9R.A: After infection of ID1-siRNA; ID1 expression decreases in H522, H1975, PC-9R, and A549 while increasing in PC-9;B: After infection of ID1-siRNA in PC-9R, p-ERK, p-AKT, p-STAT3 and p-EGFR decreased, whereas ERK, AKT, STAT3 and EGFR showed no change.Following gefitinib treatment, the extent of phosphorylation of ERK, AKT and EGFR in ID1-siRNA is lower than that in the control group.After infection of ID1-OE in PC-9, the extent of phosphorylation or non-phosphorylation of ERK, AKT and EGFR showed no change.After gefitinib treatment, the extent of phosphorylation of AKT and STAT3 in PC-9-ID1-OE is higher than that in the control group.

图5 动物实验结果。A：PC-9/R（ID1-OE）实验结果（标尺上方，第一行：对照组剥离肿瘤；第二行：灌胃组剥离肿瘤）；B：PC-9R（ID1-siRNA）实验结果（标尺上方，第一行：对照组剥离肿瘤，第二行：灌胃组因肿瘤消失，故空行），值得注意的是，ID1基因沉默后，PC-9R（ID1 siRNA）肿瘤生长极为缓慢，28天仅增长0.9倍。Fig 5 Animal experiment.A: Experimental result of PC-9/R (ID1-OE)(Above scale, first line: control group stripping tumor, second line:lavage group stripping tumor); B: Experimental result of PC-9/R(ID1-siRNA) (Above scale, first line: control group stripping tumor,second line: when the tumor disappears, the lavage group is zero).Notably, with silence of the ID1 gene, tumor growth is very slow in PC-9R (ID1 siRNA), which grew only 0.9 times after 28 days.

表1 各组肿瘤细胞IC50值和吉非替尼处理后凋亡率Tab 1 IC50 value in groups of tumor cells and apoptosis rate after treatment with gefitinib

表2 吉非替尼治疗组与对照组的瘤体体积与抑瘤率Tab 2 Gefitinib treatment group and control group in the volume of tumors and inhibitory rate