一种抗菌丝绸的制备及其抗菌作用分析*

杜 泰 陈学情 杜华茂

(1. 西南大学附属中学， 重庆 400714； 2. 西南大学生物技术学院， 重庆 400716)

一种抗菌丝绸的制备及其抗菌作用分析*

杜 泰1陈学情2杜华茂2

(1. 西南大学附属中学， 重庆 400714； 2. 西南大学生物技术学院， 重庆 400716)

桑蚕丝是一种与人体组织相容性极好的天然蛋白纤维，抗菌蚕丝在医疗卫生领域有广泛的应用前景。本文探索了直接在丝绸上嫁接纳米银的方法。用红外光谱仪分析自制的纳米银样品，发现在1 651cm-1，1 584cm-1，1 379cm-1， 1 033cm-1有特征峰，表明纳米银结合蛋白质。用戊二醛处理丝绸后加入纳米银胶体溶液，室温下处理10h, 在扫描电子显微镜下观察丝绸上纳米银的结合状态，并按《一次性使用卫生用品卫生标准》测定处理后丝绸的对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的抗菌性能。结果显示丝绸上的纳米银以分散状、成簇存在；在20min内，2cm ×3cm大小丝绸对104CFU/ml细菌的杀菌率达到90%。研究表明，用戊二醛将结合了蛋白质分子的纳米银嫁接到蚕丝蛋白上可制备抗菌丝绸。

丝绸；纳米银；抗菌

蚕丝纤维是一种蛋白质纤维，是由18种天然氨基酸组成的天然高分子材料[1]。由蚕丝纺织而成的丝绸质地柔软纤细光滑，手感细腻，与人体体表有良好的适应性。近年发现蚕丝纤维在体内稳定性较好，也可缓慢降解，表现出良好的组织相容性，已用于制备外科合线和再造血管等[2-3]。具有抗菌作用的蚕丝在医疗卫生领域将有更广泛的应用。目前有大量抗菌蚕丝的研究报道，主要是对丝胶或丝束进行抗菌物质的嫁接[4-5]，特别是嫁接纳米银的蚕丝抗菌作用强，抗菌谱广[4，6]。对于需要加工成织物才能进行抗菌性应用的蚕丝，后期加工过程对蚕丝结合的纳米银将有不同程度的影响，或者说为保持其抗菌作用，在后期加工工艺上会做出某些牺牲。本研究报道一种在丝绸上直接嫁接纳米银的方法并分析其抗菌效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料

纳米银由本实验室自制，按专利ZL 2012 1 0579134.4制备[7-8]。丝绸购于四川省南充市爱肤尔丝绸有限公司。戊二醛(分析纯，25%)。LB 培养基为上海生物工程公司产品。大肠杆菌CVCC2081，金黄色葡萄球菌CVCC1882，白色念珠菌CMCC(F)98001由黄伟博士惠赠。

1.2 红外光谱分析

取100mL纳米银胶体溶液经12 000r/min离心浓缩后再冷冻干燥。取1mg纳米银粉与120mg溴化钾充分研磨混合后压片，用傅立叶红外光谱仪(IR-6700，美国尼高立)作4 000cm-1-400cm-1波数扫描，采集红外光谱图并进行官能团分析。

1.3 纳米银的嫁接

剪取1M2丝绸，放入4%戊二醛PBS溶液中，在室温浸泡12h后用去离子水洗涤3次，以去除残留的戊二醛分子。将丝绸转入10 ppm的溶液中浸泡12h，用去离子水洗涤3次去除未结合的纳米银。至此，纳米银已嫁接到丝绸上，闭光保存。

1.4 扫描电镜分析

将处理的丝绸自然干燥后送北京中科百测分析测试中心进行扫描电镜分析，观察丝绸表面纳米银的形态。

1.5 丝绸的抗菌性能分析

按《一次性使用卫生用品卫生标准》(GB15979-2002)附录三进行抗菌性检测。主要步骤如下，将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种于LB培养基，白色念珠菌接种于土豆培养基，过夜培养后离心收集菌体，用PBS将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌浓度调至2×105CFU/mL，将白色念珠菌调为2×104CFU/mL。

将丝绸剪为2cm × 3cm大小，放入5mL灭菌的试管中。每张丝绸片上加菌液100μL。每种菌作6张丝绸小片。室温放置10min、20min后分别取出3片丝绸，每片加5mL 终止液。对照组的丝绸用75%乙醇浸泡30min后用灭菌水洗涤。取100μL涂琼脂平板进行菌落计数，每个处理样品取三份计数。试验重复三次，计算平均杀菌率，并进行t检验。

2 结果

2.1 纳米银的红外光谱特征

本研究所用的纳米银是由赤霉菌的菌丝裂解物在室温下所合成,所制备出的纳米银胶体溶液Zeta电位为-33 eV，表现为自稳定的特性[8]。将该纳米银用去离子水充分洗涤后进行红外光谱分析，结果发现在1 651cm-1、1 584cm-1有特征峰，分别代表伯胺与仲胺基团的振动，在1 379cm-1、 1 033cm-1有特征峰，代表芳香族氨基和脂肪族氨基的C-N基团的振动(见图1)，表明该纳米银结合有蛋白质。

2.2 丝绸表面的纳米银

因红外光谱分析发现赤霉菌菌丝裂解物合成的纳米银结合有氨基，所以可用戊二醛将其与蚕丝蛋白的α氨基进行偶联，达到将纳米银嫁接到蚕丝纤维上的目的。嫁接过程在室温下由两步反应完成，先将戊二醛与蚕丝蛋白结合，再与纳米银结合的蛋白质结合。在扫描电镜下清晰可见蚕丝纤维编织的规律纹理(图2A),在500倍下可见蚕丝纤维表面附着有颗粒物，这些颗粒物分散存在，大小不一(图2B)。一根丝束表面局部的附着物呈堆出现(1万倍)，在2.5万倍下可见球状的纳米银(图2 C，D)。

图1 赤霉菌合成纳米银的红外光谱图

图2 处理后丝绸织物的超微结构

图3 处理后丝绸的抗菌作用

2.3 处理后丝绸织物的抗菌作用

按《一次性使用卫生用品卫生标准》(GB15979-2002) 附C3介绍的方法测定嫁接纳米银的丝绸织物对大肠杆菌CVCC2081、金黄色葡萄球菌CVCC1882及白色念珠菌CMCC(F)98001的杀菌率。菌液在丝绸织物上保留10min、20min后测定的杀菌率如图3所示，由图可知处理10min对三类微生物的杀菌率在50%左右，对金黄色葡萄球菌的杀菌率略低；处理20min均超过90%。

3 小结与讨论

蚕丝从中国走向世界，为人类服务了数千年，赢得了“纤维皇后”之美称，蚕丝织物也享有“人体第二皮肤”的高度评价。现代生物学和现代医学正试图证明蚕丝在人类健康相关的诸多领域有更重要的应用价值[1-2]。抗菌蚕丝及抗菌蚕丝织物是其中一个研究方向，可以用于多种感染性疾病的治疗，比如烧伤和糖尿病足的治疗。

纳米银是目前最有效的抗菌材料之一，利用活性氧对蛋白质、脂类和核酸的广泛破坏作用发挥其杀灭细菌、真菌和病毒的功能。活性氧的产生有两种途径，一方面是纳米银不断释放的银离子，另一方面纳米银本身。因此，从理论上讲，只要使蚕丝结合上纳米银，就负于其抗菌性能。人们探索了多种方法将纳米银修饰到蚕丝或嫁接到蚕丝织物表面[4-5]。本文报道了一种相对简单的方法，利用戊二醛对蛋白质的偶联作用将纳米银结合到蚕丝织物表面，处理后的丝绸的杀菌率达到了90%。这一方法的可行性主要得益于近年来兴起的生物法合成纳米银技术，即利用细菌或真菌还原硝酸银，生成的纳米银可与反应体系中蛋白质的氨基、巯基结合，以形成稳定的纳米银胶体。本研究用红外光谱仪检测赤霉菌合成纳米银样品中有伯氨、仲氨及芳香族氨基酸的C-N等基团的特异性振动峰，这与先前的报道相一致[10]。

抗菌蚕丝在临床上的应用尚需大量实验数据的支撑，除生物学角度的研究外，还需要医学相关人员的加入，以评价其作为外科敷料或填料在组织学上的可行性。

致谢：感谢刘英帅博士在红外光谱分析中的技术支持。

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*资助项目：中央高校基本业务费专项基金(XDJK2016E105)。

杜华茂，博士，副教授。Email: duhmao@swu.edu.cn