长链非编码RNA是新的调控因子*

吴松原 代方银

(农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室，西南大学 生物技术学院，重庆 400716)

长链非编码RNA是新的调控因子*

吴松原 代方银

(农业部蚕桑生物学与遗传育种重点实验室，西南大学 生物技术学院，重庆 400716)

近年来长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)在多个物种中的研究逐渐升温。lncRNAs属于非编码RNA类型，在各物种中普遍存在。研究发现，lncRNAs在发育过程中对重要相关基因具有调控作用。越是在发育复杂的高等生物体中，其基因组产生越多的lncRNAs，其与生物进化呈正相关。在本文中，综述了lncRNAs作为重要的调控因子参与胚胎发育、染色体失活、神经发育等过程，为进一步研究lncRNAs提供参考。

长链非编码RNA；基因调控；发育；进化

随着高通量测序技术的发展，越来越多物种的基因组信息被公布，生物学研究普遍进入后基因组时代。重要的编码蛋白的功能基因研究为许多表型性状提供了重要的信息。但基因的精确时空表达是如何产生，仍需进一步的研究。学界认为，基因的表达模式主要是其基因组座位上的顺式调控元件与转录因子相互作用的结果。顺势调控原件的编辑，比如删除或增加可以改变基因的表达模式，这为该理论提供了重要的支撑。但基因的调控方式并非如此单一，多物种的转录组深度测序发现了数量众多的非编码RNA(non-coding RNAs)，先前认为，它们是转录过程中由于RNA聚合酶Ⅱ的非特异结合产生的转录噪音。但随着研究深入发现，非编码RNAs具有重要的调控功能。非编码RNAs可分成多个类型，包括，核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)、核内小RNA (snRNA)、核仁小RNA (snoRNA)和microRNA 等。

长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸，没有长的阅读框，但往往具有mRNA的结构特征，其5’端有帽子结构，3’端有poly A尾巴的RNA类型[1]。转录组比较分析发现在具有基因组数据的哺乳动物中至少有2/3的基因组DNA存在转录，但最终只有大约2%的转录本可以翻译为蛋白质[2-3]。在家蚕(Bombyxmori)中，根据目前已公布的RNA测序数据，统计发现有6281个lncRNAs[4]，但其真实的lncRNAs数量应远远超过该数值，所以，新的lncRNAs仍待进一步的挖掘。此外，随着生物的复杂程度增加，其lncRNAs的数量也在上升。这暗示，非编码RNA可能参与有机体的进化发育。lncRNAs的核酸性质赋予其双重能力，一是作为蛋白质的配体，二是通过碱基配对原则参与核酸相互作用，这两种活性与microRNAs (miRNAs)的作用机制相同。然而，不同于小RNA的是，lncRNAs可以折叠成复杂的二级和高级结构提供更大的蛋白和靶序列识别潜力[5]。

在多组织和细胞类型中通过深度的RNA测序，对lncRNAs的表达进行了定量分析。分析发现，lncRNAs相比于蛋白编码基因具有更多的细胞类型特异性表达[6]。同时，在细胞的不同分化阶段lncRNAs存在差异表达，这表明他们可能是细胞分化的重要因子[7]。在本文中，我们综述了lncRNAs参与发育过程中的重要作用，为进一步研究lncRNAs提供帮助。

1 长链非编码RNAs的作用形式

1.1 核内lncRNAs

研究显示，大多数核内lncRNAs是通过引导特定的基因组位点的染色质修饰来行使功能[8]。在多数情况下，lncRNAs招募DNA甲基转移酶3(DNMT3)和组蛋白修饰因子，如多梳抑制复合体(Polycomb repressivecomplex，PRC2)[9-10]，以及组蛋白H3赖氨酸9(H3K9)甲基转移酶[11-12]。这些组蛋白和基因组DNA的修饰主要与异染色质的抑制有关[13]。另外，lncRNAs本身可以通过招募染色质修饰复合物，比如组蛋白 H3K4 甲基转移酶MLL1复合体对基因表达进行正调控[14]，也可通过改变染色质三维构象来激活特异的增强子行使转录激活功能[15]。

相对于lncRNAs的靶基因在基因组上的座位，可以将lncRNAs作用方式分为顺式或反式作用。顺式作用是lncRNAs调控其基因座邻近基因的表达。而反式作用的lncRNAs可调控其他染色体上的基因表达[5]。但基于相关的编码蛋白基因可分为：sisRNAs(stable intronic sequence RNA)、ciRNAs(Circular intronic RNAs)、Sense ncRNA、Mirror antisense、asRNAs(Natural antisense ncRNA)、ecircRNAs(Exonic circular RNAs)、uaRNA(Stand-alone ncRNAs made from 3 0UTRs)、ciRNA(Chromatin-interlinking RNA)以及TSSa-RNAs(Transcription start site-associated RNAs)等；基于功能可分为：ncRNA-a(Long noncoding RNAs with enhancer-like function)、miRNA primary transcripts、piRNA primary transcripts以及ceRNA(Competing endogenous RNA)等[16]。

1.2 细胞质内的lncRNAs

在细胞质中lncRNA也可介导基因调控[1]，这些lncRNAs往往基于碱基配对的方式进行目标识别。他们可参与翻译调控，比如lncRNAs、Uchl1-as1(ubiquitin carboxy-terminalhydrolase L1 antisense RNA 1)可产生正调控[17]，Trp53cor1(tumour protein p53 pathway corepressor 1)引起负调控[18]。同样，lncRNAs可以调节mRNA的稳定性，比如BACE1-AS(β-site APP-cleaving enzyme 1-antisense，)[19]和组织分化诱导的非编码RNA(tissue differentiation-inducing nonprotein-coding RNA，TINCR)[20]可增加他们靶mRNA的稳定性。相反，1/2sbsRNAs(half-STAU1 (staufendouble-stranded RNA-binding protein 1)-binding site RNAs)可降低靶mRNA的稳定性[21]。

还存在一种特殊的lncRNAs，其可作为内源性竞争RNA(competing endogenous RNAs，ceRNAs)[22]，这种RNA通过竞争性结合特定的miRNA保护靶mRNA免受抑制。这种机制首先在植物中被鉴定到[23]，随后在哺乳动物中也被发现[24]。ceRNAs在许多细胞程序中，包括肿瘤[25]，细胞分化和细胞多能性中都被证明有重要关联[26]。另外2011年还鉴定了一个新的ceRNAs类型，环RNA(circular RNAs，circRNAs)。他们是作为神经元细胞中的“miRNA海绵”，竞争性吸附靶miRNA。相比于线性的ceRNA，circRNAs具有更强的稳定性[27]。

2 lncRNA与X染色体失活

X染色体失活特异转录本XIST(X-inactive specific transcript)是诱导X染色体失活的重要lncRNAs[28]。XIST位于X染色体上，通过顺式作用来诱导 X染色体转录失活。并且，它只是在失活诱导的启动时作用，而不需要持续作用来维持X染色体失活[28]。在小鼠中删除XIST可抑制X染色质失活，从而造成雌性特异致死[29]。研究发现，XIST与染色质的相互作用涉及转录抑制蛋白YY1，XIST通过结合转录抑制蛋白YY1的第一外显子，从而行使功能[30]。然而，其他研究显示XIST能够识别X染色体的三维构象[31]，所以，并不一定只通过转录抑制蛋白YY1，可能存在其他的作用机制。

同时，XIST本身的转录是由其他lncRNAs通过正调控和负调控的方式协同控制的[28]。其中最典型的XIST的调控子是其自身的反义非编码转录本TSIX，它通过诱导抑制XIST启动子区域的表观遗传修饰来抑制XIST的转录[28]。在小鼠中，TSIX的功能缺失，导致XIST在体内出现异位表达，X染色体失活过程异常和早期胚胎致死[32]。该研究暗示，自然产生的反义转录本是基因表达调控的重要的因子。此外，XIST的活性需要另一个lncRNAs，Jpx的作用[33]，它通过封闭转录阻遏因子 CTCF来正调控XIST转录[34]。可能存在其他的调控方式，还需要进一步的研究。

3 lncRNAs与基因组印记

在雌雄配子形成期间，印记基因通常只沉默一个亲本的染色体。印记区域编码的lncRNAs通常较长(大于100Kb)，并且通过顺式作用，直接结合到印迹区域参与沉默[28]。

Kcnq1ot1(Kcnq1overlapping transcript 1)和Airn(antisense lgf2rRNA)是亲本表达的lncRNAs，他们通过顺式作用抑制侧翼的编码蛋白基因。研究发现他们参与小鼠胚胎早期发育，在胚胎中这些lncRNAs功能缺失不会致死，但引起父系遗传的印记丢失和生长缺陷，而该等位基因的母系遗传印记和生长不受影响[35-36]。在不同组织中lncRNAs通过不同的方式参与调控。例如，在胚胎发育过程中，Kcnq1ot1通过建立和维持周围基因的DNA甲基化的抑制而行使功能。而在胎盘中，它通过招募抑制组蛋白修饰的PRC2复合体和H3K9甲基转移酶EHMT2进行作用[35]。

另外发现lncRNAs可通过持续转录来调控基因表达。Airn是lgf2r基因的反义转录本，其通过顺式作用沉默父本的lgf2r等位基因。在胚胎中，Airn沉默父本的lgf2r基因，并不是通过稳定的成熟RNA产物，而仅仅基于Airn的持续转录，反义链的持续转录可干扰正义链的lgf2r基因转录起始位点对RNA聚合酶Ⅱ的招募从而抑制其表达[37]。然而，在胎盘中，通过形成成熟的Airn，进而招募EHMT2来诱导染色质抑制的形成[28]。这些研究表明，一个lncRNAs在不同细胞类型中可能是通过不同的机制作用，另外lncRNAs通过顺式调节基因表达具有优势，因为相比长距离的反式作用，顺式作用要更简单和直接[38]。

4 lncRNAs调控HOX基因

Hox基因是一簇进化上高度保守的转录因子家族，他们沿着体轴从头到尾负责胚胎的躯体模式发育。在黑腹果蝇中，有8个HOX基因成员成为一簇[39]。在哺乳动物中，存在39个HOX基因成为4簇(HOXA、HOXB、HOXC和HOXD)，他们位于不同的染色体位置[40]。除了这些编码蛋白基因，该基因组区域也产生数量众多的lncRNAs，他们与其临近的编码蛋白基因呈现类似的时空表达模式。其中一些lncRNAs直接参与HOX基因的调控[41]。

4.1 顺式作用的lncRNAs

HOTTIP(HOXAdistal transcript antisense RNA)，是一个激活转录作用的lncRNAs，其在脊椎动物中保守存在。HOTTIP从HOXA座位的5端开始转录，它可直接结合衔接蛋白WDR5以及组蛋白修饰复合体MLL1，来调节组蛋白的表观遗传修饰从而诱导它下游的几个 HOXA基因转录[14]。在鸡的胚胎中，下调该转录本，导致肢的形态转换[14]。

Mira(mistral lncRNAs)是一个鼠特异的lncRNAs，它在HOXA座位转录。在鼠的胚胎干细胞中，Mira正调控两个相邻基因HOXA6和HOXA7的转录。在鼠的胚胎干细胞中敲除Mira可抑制胚层特化基因的激活，这暗示Mira是鼠胚胎干细胞分化的早期重要因子[42]。然而，并不清楚Mira与HOXA6和HOXA7作用的细节，因为在鼠中删除HOXA6和HOXA7，是影响胚胎的后期发育阶段，而不是前期[43]。

在黑腹果蝇中，当Abd-B基因表达缺失时，Abd-A在后部体节会出现异位表达，而在中枢神经系统中缺乏这种异位表达。研究发现，在果蝇的中枢神经系统中存在一个长约92Kb的lncRNA，iab-8。其从Abd-A基因的5′端开始转录，它通过产生iab-8 miRNA对Abd-A基因进行顺式的转录抑制调控[44]。

4.2 反式作用的lncRNAs.

HOTAIR(HOX transcript antisense RNA)是被鉴定的第一个具有反式作用的lncRNAs[9]。HOTAIR在HOXC基因簇上转录，但它却是HOXD簇的一个抑制因子。HOTAIR通过招募PRC2和KDM1A-coREST-REST(lysine-specific histone demethylase 1A-REST corepressor 1-RE1-silencing transcription factor)组蛋白修饰复合体[9]，去特异结合靶基因产生反式作用功能。实际上，在人的成纤维细胞中下调HOTAIR的表达，导致这些抑制型复合物的活性下降，以及HOXD基因簇上的基因表达上调[45]。在鼠中的HOTAIR敲除模型也被建立成功，HOTAIR的删除导致发育缺陷和骨骼系统的同源转换，同时，PRC2和KDM1A-coREST-REST抑制型组蛋白修饰复合体活性降低，以及HOXD上的基因表达变化[46]。但有趣的是，整个鼠HOXC座位缺失，导致围产期致死，但没有发现其骨骼发生同源转换。然而，单独的敲除包含HOTAIR的组件，可以发现骨骼转换，但没有其他发育障碍[47-48]。推测，可能HOX基因的其他簇中存在补偿HOXC的潜在机制，或者在HOXD中存在与HOTAIR功能相对的原件。

5 lncRNAs参与脑和中枢神经系统发育

中枢神经系统(CNS)的细胞存在极为丰富的lncRNAs转录，并且在中枢神经系统中lncRNAs数量与物种的进化复杂性存在相关性，物种进化程度越高，中枢神经系统中的lncRNAs越多[49]。

在神经系统中，Malat1(metastasis-associatedlung adenocarcinoma transcript 1)是目前最为关注lncRNAs之一。在鼠神经中，该lncRNA呈现高水平的表达。在鼠的海马神经元中Malat1的下调可引起突触密度以的下降，以树突生长受限[50]。进一步的，鼠的Malat1功能缺失遗传模型显示，仅发现少数几个基因表达改变，包括Malat1的相邻基因，因此推测Malat1主要行使顺式调控功能，仅对邻近的少数基因负责[51]。

在多种脑细胞类型中相对于编码蛋白基因，lncRNAs的表达模式更为复杂[52]。转录组分析发现在灵长目或是人脑中存在特有的lncRNAs[53]。通过分析这些lncRNAs，发现其基因座，存在明显的正选择，以及加速进化的特征。这些研究暗示，lncRNAs在人脑的进化中可能有重要的作用，比如在认知和行为方面[54]。lncRNAs，HAR1A(highly accelerated region 1A)从类人猿到人，呈现快速进化模式。其表达水平与脑发育的重要蛋白reelin有重要关联。这暗示，它可能以类似的方式参与脑的发育[38]。与之对应的是从鸟到哺乳动物脑中均高度保守的lncRNAs，他们具有类似的时空表达模式，这些lncRNA可能是脑发育的祖先因子[55]。

此外，脑中表达的lncRNAs多起源DNA中的超级保守区域(ultraconserved regions，UCRs)，他们经常与那些编码关键的发育调控基因重叠或者反义。例如在小鼠中，Dlx6os1(co-activator lncRNA Dlx6 oppositestrand transcript 1)，它是Dlx6(distal-lesshomeobox 6)的一个反义RNA。小鼠中的这些Dlx基因与黑腹果蝇的Dll(distal-less)基因同源，他们编码包含homeodomain的转录因子，参与前脑和颅面发育。Dlx6os1通过顺式和反式作用的方式调控Dlx5、Dlx6和Gad1(glutamate decarboxylase 1)的表达。在顺式作用中，Dlx6os1的转录负调控Dlx6基因的表达；在反式中，Dlx6os1招募激活子转录因子homeobox蛋白DLX2以及抑制子MECP2(methyl-CpG-binding protein 2), 来调节Dlx5和Gad1的表达。在小鼠中缺失功能的Dlx6os1，在产后的早期海马体中，其γ-氨基丁酸中间神经元(一种神经元，使用γ-氨基丁酸作为神经递质，它可以抑制兴奋反应)的数目减少；在成体时，Gab1的RNA水平回复正常，但突触抑制存在缺陷，该研究显示Dlx6os1在神经元中发育中具有重要作用[56-57]。

Dlx1os与Dlx6os1拥有基本类似的功能和特征，Dlx1os可以通过顺式调节其反义转录基因Dlx1的表达水平和稳定性。缺失功能的Dlx1os小鼠拥有轻度的骨骼和神经表型，这与Dlx1过表达表型基本一致[58]。

6 lncRNA与心脏发育

在小鼠中鉴定到两个lncRNAs，Bvht(braveheart)和Fendrr(Foxf1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA)参与心脏发育。在小鼠的胚胎干细胞以及心肌细胞中通过RNAi降低Bvht的表达水平，可影响心脏特异基因的表达，并导致胚胎干细胞发育为成熟的心肌细胞。该研究暗示，Bvht可能参与心脏组织受损后的恢复。同样，通过RNAi降低大约60%的Fendrr表达水平，在体内并没有显示出任何明显的表型。相比之下，fendrr座位的敲除导致小鼠在胚胎期致死，并且其心脏功能受损[59-60]。说明，RNAi技术在lncRNAs研究中存在局限性，敲除系统是lncRNAs功能研究的重要手段。

lncRNAs参与心脏的发育，但对成体心脏的功能研究较少。肌球蛋白重链7是心脏收缩的重要蛋白，在人和鼠中，该基因座存在一类lncRNAs，Myheart(myosin heavy-chain-associated RNA transcripts)，其在成体心脏中特异的表达。相关病理性压力可以激活Brg1-Hdac-Parp染色质抑制复合体3来抑制心脏中Mhrt的转录，Mhrt的转录降低对心肌疾病的进一步发展具有重要关联，恢复Mhrt的转录水平可以保护心脏肥大和心力衰竭。研究发现，染色质重塑因子Brg1是Mhrt的拮抗因子，它可以被心肌病以及异常的基因表达所激活，从而进一步使心脏疾病恶化。Mhrt可以通过Brg1的解旋酶结构域竞争性的结合该因子从而保护其靶点基因组DNA免受染色质重塑，来保护心脏[61]。

7 lncRNAs的其他功能

在小鼠的精母细胞中，睾丸细胞粘附分子1基因Tcam1具有重要作用，长链非编码RNA，CNS1(conserved noncoding sequence)座位于该基因的上游3.4Kb处，其与组蛋白H3K4单甲基化相关。在GC-2spd(ts)细胞中，CNS1可以增强Tcam1的启动子活性从而激活并限制其在精母细胞中特异表达，同时发现，CNS1可以驱动邻近基因Smarcd2，以及lncRNA-Tcam1的表达。有趣的是，smarcd2呈现广泛性的表达模式，而lncRNA-Tcam1仅在睾丸生殖细胞中表达[62]。

通过深度测序发现lncRNAs与免疫存在重要关系，lincRNA-Cox2是一种炎症诱导型的lncRNA，它可以激活和抑制不同的免疫基因[63]。在植物中，lncRNAs与病毒入侵有关，相关的lncRNA在感染的细胞中高度积累，可能通过沉默相关病毒基因从而行使功能[64]。

8 讨论

lncRNA的鉴定以及功能研究为基因的时空表达模式调控提供了新的内容。同时，编码蛋白基因的座位常常转录相关的lncRNAs，这种复合结构，由于序列的变更，常常引起lncRNAs以及基因表达模式的变化引起表型分化，lncRNAs在物种的进化中可能起到了重要的作用。在各物种中，不管是新lncRNAs的鉴定，还是解析他们的功能和作用机制，lncRNAs都是目前聚焦的问题之一。

lncRNAs是如何产生和进化的，有学者认为，转座子是lncRNAs的起源、分化和调控的主要动力[65]。在脊椎动物中，超过2/3的成熟lncRNAs中发现包含转座子序列，然而在蛋白编码的mRNA中很少存在转座子序列。转座子序列可以对基因的转录产生调控，研究发现在lncRNAs座位，特别是在lncRNAs的转录起始位点常常发现存在转座子原件，这也暗示转座子参与非编码RNA的转录调控。同时，转座子原件的跳跃改变，可能改变相邻lncRNAs的表达模式，从而贡献lncRNAs的进化[65]。

在lncRNAs的研究当中，鉴定lncRNAs是首要的。要提取各细胞类型和发育时期的各种lncRNAs信息进行组学的研究，需要基于进步的高通量测序手段。测序技术的不断进步提供了这个可能，相对于二代测序仅得到100bp左右的短片段，难以正确拼接，以至于难以组建完整的可变剪切形式。三代测序技术的兴起改变了这一现状，该平台具有超长读长的功能，可以测通每条lncRNAs，从而一次性解决lncRNAs的鉴定，以及多种剪切形式的分析[66]。

得到lncRNAs序列之后，需要进行生物信息学的分析，初步推测lncRNAs的功能。然而，lncRNA的序列进化程度比编码蛋白基因要迅速许多，往往保守程度不直接与功能相关，比如大脑在大脑中呈现快速进化形式的HAR1A。同时，lncRNAs涉及多种多样的功能，阐述lncRNAs在不同细胞类型中的功能是重要的议题，其核心是寻找适合的研究模型系统，体外的和体内的。然而，由于lnRNAs进化程度很快，很难寻找到适当的动物模型。所以，对lncRNAs的功能和分化进行研究需要进一步发展更适合的策略。

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Long Non-coding RNAs-a Newly Emerging Regulation Factor

WU Song-yuan DAI Fang-yin

(KeyLaboratoryofSericulturalBiologyandGeneticBreeding，MinistryofAgriculture，SouthwestUniversity，Chongqing400716,China)

lncRNAs (long non-coding RNAs) belong to non-coding RNAs，which are widespread in different species. In recent years, lncRNA has been attracting increasingly greater attention of researchers of various species. They have found in their studies that lncRNAs are important for the regulation of important genes. In addition，the more complex an organism is，the more lncRNAs is produced by its genome，which is positively correlated with biological evolution. In the present review, we give a summary of the processes in which lncRNAs as an important regulatory factor are involved, including embryonic development，chromosome inactivation, neural development and some others, which provides a reference for further study of lncRNAs.

lncRNA; Gene regulation; Development; Evolution

*资助项目：国家863计划项目(项目编号：2013AA105207)；国家自然科学基金面上项目(项目编号：31372379)；国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-22)。

吴松原(1985-)，博士，博士后研究人员，从事家蚕资源生物学与遗传育种研究。

代方银(1969-)，男，博士，教授，博士生导师。主要研究方向：家蚕遗传育种及蚕桑产业技术。E-mail：fydai@swu.edu.cn