9470例孕中期高危孕妇外周血胎儿游离DNA无创产前检测结果分析

侯菲，孙娜，高凤春，戴莹，李燕，金华

(1. 济南市妇幼保健院产前诊断中心，山东 济南 250001；2. 山东第一医科大学(山东省医学科学院期刊)编辑部；3.济南市妇幼保健院产科；4. 济南市妇幼保健院检验科；5. 济南市妇幼保健院手术室)

近年来，新生儿出生缺陷的发生率逐渐升高，据报道，染色体异常是最常见的病因[1-3]。染色体非整倍性是指细胞的染色体数多或少了一条或多条。其中，21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕特氏综合征)是最常见的三种染色体非整倍体疾病，其在新生儿的发病率分别为1/600～1/800、1/6000、1/10000[4]。染色体异常的患儿大多数表现为不同程度的智力低下，或同时合并器官畸形，通常伴有生活自理困难，给家庭、社会都造成了较大的经济负担。目前，针对遗传因素导致的出生缺陷尚无有效的治疗手段，通过产前筛查和产前诊断的方式，可以预防此类出生缺陷的发生[5-7]。

研究表明，80%～95%的母体DNA片段和5%～20%的胎儿游离DNA片段共同存在于母体的外周血中[8]。那么，当胎儿为某染色体三体时，母体外周血中的胎儿游离DNA也同样为三体，这使得母体外周血中该染色体的游离DNA比例与正常孕妇相比是升高的。这一比例改变可被高通量测序技术进行大规模DNA分子序列分析时准确检测到，从而可以针对21-三体综合征、18-三体综合征或13-三体综合征进行产前辅助判断[8-10]。因此，孕妇外周血胎儿游离DNA无创产前检测(NIPT)近年来广泛应用于胎儿染色体非整倍体的产前筛查。本文通过分析9470例孕妇外周血胎儿游离DNA NIPT检测情况，探讨此检测在胎儿染色体非整倍体产前筛查中的应用价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象

选择于2017年7月至2020年7月在济南市妇幼保健院进行外周血NIPT的孕妇9470例，采集标本前，所有孕妇均已签署知情同意书。

1.1.1 纳入标准

(1)35岁以上的高龄孕妇(以预产期日期计算，预产期年龄≥35岁的孕妇)；

(2)血清学筛查高风险的孕妇；

(3)血清学筛查临界风险孕妇；

(4)曾生育过染色体病患儿的孕妇；

(5)产前B超检查怀疑胎儿可能有染色体异常的孕妇；

(6)夫妇一方为染色体异常携带者；

(7)医师认为有必要进行产前诊断的其他情形。

符合以上条件之一的高危孕妇，即可入组进行分析。

1.1.2 排除标准

孕妇近期曾接受过免疫治疗、异体输血、移植手术或造血干细胞治疗等；溯源信息不完整的数据。

1.2 方法1.2.1 NIPT检测方法

使用华大生物科技(武汉)有限公司胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)，EDTA抗凝管采集孕妇外周血10 mL，离心并提取血浆中胎儿游离DNA，聚合酶链反应扩增建立文库，采用基因测序仪(BGISEQ-500，深圳华大基因生物医学工程有限公司)进行高通量基因测序及数据分析。

1.2.2 金标准

根据中国人民共和国卫生部发布的《WS322.2-2010胎儿染色体异常与开放性神经管缺陷的产前筛查与诊断技术标准》第2部分：胎儿常见染色体异常的细胞遗传学产前诊断技术标准[11]，以介入性产前诊断手术结果(羊膜腔穿刺术)和出生随访结果作为确诊胎儿染色体非整倍体T21、T18、T13的对照“金标准”。NIPT结果为阳性的孕妇介入性产前诊断为染色体异常的胎儿终止妊娠，NIPT结果为阴性的孕妇不需要进行介入性产前诊断，通过出生后的随访作为金标准。

1.2.3 介入性产前诊断

超声引导下行羊膜腔穿刺术，抽取羊水25 mL，对羊水细胞进行培养、观察、消化、低渗、固定、滴片、烤片、分带、G染色等步骤处理，最后进行染色体核型分析计数。

1.2.4 妊娠结局随访

随访范围包括进行NIPT检测的所有孕妇，随访内容包括产前诊断结果、妊娠结局等。

1.2.5 数据收集及血清学、超声筛查判定标准

收集可溯源的样本编号、临床诊断结果、孕周、孕妇年龄、唐氏血清学筛查结果、金标准结果等，记录并保存。对全部收集数据进行统计分析。

血清学唐筛高风险判定值：T21为1/270，T18为1/350。

血清学唐筛临界风险判定值：T21为1/270～1/1000，T18为1/350～1/1000。

超声NT筛查异常判定值：NT值≥3.0+

1.2.6 诊断效能

对阳性符合率、阴性符合率、总符合率和一致性系数Kappa(K)值进行评价。阳性符合率、阴性符合率、总符合率：取值范围在0%～100%之间，其值越接近于100%，结果越理想。Kappa值在0～1间判断一致性才有意义，Kappa值越大，表示一致性越好。

1.3 统计学方法

(1)四格表见表1。

表1 NIPT检测结果与金标准配对四格表

(2)计算NIPT检测的灵敏度、特异度和总符合率：

灵敏度=a/(a+c)×100%

特异度=d/(b+d)×100%

总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%

(3)计算一致性系数Kappa(Κ)值：

(4)计算NIPT检测的阴性预测值、阳性预测值：

阳性预测值=a/(a+b)×100%

阴性预测值=d/(c+d)×100%

(5)灵敏度、特异度、总符合率、阳性预测值及阴性预测值95%CI：

①>90%，采用Wilson score方法计算95%CI；②<90%采用公式p±1.96×[p(1-p)/n]1/2计算。

(6)定性资料以[n(%)]表示。

2 结果

2.1 人口学资料和分组

9470例孕妇病例中，孕妇预产期年龄18～49岁，平均(33.41±4.75)岁，其中高龄孕妇4867例(51.39%)，低龄孕妇4603例(48.61%)；孕妇孕周12.29～34.00周，平均(18.09±2.14)周；血清学筛查(T21或/和T18)高风险780例(8.24%)，血清学筛查(T21或/和T18)临界风险3660例(38.65%)，染色体病患儿生育史0例(0%)，B超检查异常(含NT筛查)128例(1.35%)，夫妇一方为染色体异常携带者0例(0%)，医师认为有必要的其他情形0例(0%)。

2.2 NIPT检测结果

NIPT检测结果见表2。

表2 NIPT检测结果(n=9470)

2.3 金标准检测结果

9470例孕妇以出生随访结果作为“金标准”结果的有9402例(99.28%)，以介入性产前诊断(羊水穿刺/脐带血穿刺/绒毛取材)结果为“金标准”的有68例(0.72%)。介入性产前诊断结果见表3。

表3 介入性产前诊断结果(n=68)

2.4 NIPT检测与金标准检测结果对比

(1)按照年龄进行分组，4867例高龄孕妇，NIPT检出阳性共39例，其中T21阳性23例，T18阳性7例，T13阳性9例；“金标准”对照结果阳性26例，其中T21阳性21例，T18阳性5例，T13阳性0例。见表4。NIPT检测的诊断效能见表5。

表4 高龄孕妇NIPT检测与金标准检测结果比较

表5 高龄孕妇NIPT检测的诊断效能

对表中的数据进行Kappa一致性分析，算得Kappa=0.80，95%CI为0.69～0.91，P<0.05，表明在高龄孕妇组两种方法总体比对结果有较好的一致性。

(2)4603例低龄孕妇NIPT检出阳性共30例，其中T21阳性15例，T18阳性10例，T13阳性4例，T21/T18双阳性1例；“金标准”对照结果阳性16例，其中T21阳性14例，T18阳性2例，T13阳性0例。见表6。NIPT检测的诊断效能见表7。

表6 低龄孕妇NIPT检测与金标准检测结果比较

表7 低龄孕妇NIPT检测的诊断效能

对表中的数据进行Kappa一致性分析，Kappa=0.69，95%CI为0.54～0.85，P<0.05，表明在低龄孕妇组两种方法总体比对结果有一定的一致性。

(3)T21/T18/T13三体总体结果分析

9470例孕妇中NIPT检出阳性共69例，其中T21阳性38例，T18阳性17例，T13阳性13例，T21和T18三体双阳性1例；“金标准”对照结果阳性42例，其中T21阳性35例，T18阳性7例，T13阳性0例。见表8。NIPT检测的诊断效能见表9。

表8 NIPT检测与金标准检测结果比较

表9 NIPT检测的诊断效能

对表中的数据进行Kappa一致性分析，Kappa=0.76，95%CI为0.67～0.84，P<0.05，表明两种方法总体比对结果有较好的一致性。

3 讨论

近年来，利用母体外周血中胎儿游离DNA进行无创性产前筛查胎儿染色体非整倍体已被广泛应用。孕妇外周血中游离DNA大部分来源于胎盘的滋养层细胞，所以，正常情况下通过检测孕妇外周血胎儿游离DNA水平就可以获得与胎儿相同的结果[12]。与传统的血清学产前筛查原理相比，NIPT检测具有更高准确性，同时，又在一定程度上可以降低因不必要的侵入性产前诊断带来的流产、胎膜早破、宫内感染等风险，为孕中期的高危孕妇提供了相对较为理想的产前筛查途径，对降低出生缺陷具有重要的临床价值[13-15]。

尽管如此，本文结果显示孕中期高危孕妇的外周血胎儿游离DNA进行无创性产前筛查与介入性产前诊断结果的比较，NIPT检测相对产前诊断，具有一定的假阳性。原因可能为:(1)2%的胎盘存在特异度嵌合体，胎盘特异度嵌合体指的是胎盘染色体是阳性但胎儿染色体正常，或胎盘染色体是阴性但胎儿染色体异常的情况[16]。由于游离DNA检测的DNA片段来自胎盘绒毛外层的滋养层细胞，因此，该种情况NIPT方法无法解决。(2)母体外周血中存在的胎儿游离DNA水平的浓度对检测结果的准确性存在强相关性[17]。(3)母体染色体非整倍体和拷贝数变异影响。

总之，NIPT检测与羊水细胞染色体检查的定位不同，也就是说，我们同样不能忽略羊水细胞染色体检测的重要性，例如超声筛查提示胎儿存在结构性异常或怀疑染色体异常，仍然需要以介入性产前诊断的方式进行染色体检查。介入性产前诊断是胎儿染色体异常诊断金标准[9]。

综上所述，NIPT可用于胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合征、18-三体综合征或13-三体综合征的产前筛查，与产前诊断技术或出生随访作为“金标准”对比，其总体准确性和有效性符合临床实际应用的需求，值得推广应用。