基于网络药理-分子对接探讨活血疏肝汤促进膝关节置换术后加速康复的机制※

杨澜波 米豫飞 邹春雨 王战朝

20 世纪90 年代，Kehlet 率先提出术后加速康复（Enhanced Recovery After Surgery，ERAS）的概念[1]。加速康复是在循证医学的基础上，通过一系列优化围手术期治疗的措施来加快康复过程。它最早用于胃肠道手术，取得了令人满意的效果，近年来逐渐推广至其他学科[2]。膝关节置换术（Total Knee Arthroplasty，TKA）是终末期膝骨关节炎最有效的治疗方法之一[3]。据报道，美国每年进行TKA 手术70 万例，预计2030年将增加到348万例[4]。在TKA中，ERAS的核心是减少手术应激反应，减轻围手术期疼痛，降低深静脉血栓等并发症的发生率，加速功能恢复[5-6]。目前，TKA 术后抗血栓及镇痛治疗以药物为主，但存在出血、抗血栓作用不足、心血管意外、肝肾功能损害、嗜睡、恶心呕吐及长期成瘾等潜在风险[7]。因此，开发安全有效的抗血栓镇痛药物是目前TKA 术后加速康复研究中亟待解决的问题。

活血疏肝汤是国家级非物质文化遗产平乐郭氏正骨法的经典名方，根据骨伤科疾病三期用药理论辨证论治组方而成，具有行气疏肝、活血止痛的作用。杜志谦[8]等通过动物实验证实，活血疏肝汤具有良好的抗炎镇痛作用。乔清奎[9]报道，临床应用活血疏肝汤可显著降低TKA术后疼痛，无明显不良反应。张晓辉[10]报道，活血疏肝汤具有减少腰椎术后下肢深静脉血栓发生的作用。同时，本研究相关的临床试验显示，活血疏肝汤对TKA术后血栓及疼痛的有效率分别为85.94%及93.19%，但其抗血栓镇痛的具体机制尚不清楚。

本研究利用网络药理学及分子对接技术，获取了活血疏肝汤的有效成分，并预测了这些成分的有效靶点，在分子水平上挖掘活血疏肝汤在TKA术后抗血栓及镇痛作用方面的潜在机制，为活血疏肝汤在TKA术后快速康复中的广泛应用与新药物的开发提供理论支持。

1 方法

1.1 活血疏肝汤有效成分筛选活血疏肝汤由当归、红花、桃仁、柴胡、大黄、黄芩、甘草以及枳壳共8味中药组成。在中医药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中检索各味中药所含的有效成分，根据口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30% 和类药性指数（Drug Like Index，DL）≥0.18 等参数对活血疏肝汤的有效成分进行筛选。

1.2 药物-成分-靶点网络的构建将筛选获得的有效成分转换为PubChem_CID，导入中医药分子机制生物信息分析数据库（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism for Traditional Chinese Medicine，BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php），将参数设定为Score cutoff＞20，P＜0.05，获得活血疏肝汤的有效靶点。根据筛选获得的有效成分及靶点，构建药物-成分-靶点网络。

1.3 药物与疾病共有靶点的获得从毒性与基因比较数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http://ctdbase.org/）中获得有关术后血栓（Venous Thrombosis）及疼痛（Postoperative Pain）的所有靶点，根据相关分数（Inference Score）＞50 选取有效疾病靶点。从DisGeNET 数据库（https://www.disgenet.org/home/）中获得有关血栓（Thrombosis）及疼痛（Pain）的靶点，根据基因-疾病关联分数（Score-gda）＞0.1 选取有效疾病靶点。将两个数据库获得的疾病靶点合并，获得TKA 术后血栓及疼痛相关的疾病有效靶点。取疾病靶点与药物靶点的交集，获得共有靶点。

1.4 共有靶点的分析与筛选将获得的共有靶点输入STRING 11.0 数据库（https://string-db.org/），种属参数设置为人（Homo sapiens），得出共有靶点的蛋白质间相互作用（Protein Protein Interaction,PPI），以Combined Score＞0.4 为筛选标准，将筛选后的信息导入Cytoscape 3.6.0 软件绘制PPI网络并进行网络拓扑分析，根据度值（Degree）＞平均值筛选出关键共有靶点。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）功能与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析Metascape 数据库（http://metascape.org/）可用于GO功能和KEGG信号通路富集分析，并且具有时效性和准确性的优点。将关键共有靶点上传至Metascape，种属参数设置为人（Homo species），即可获得富集分析结果。

1.6 核心成分与高频靶点蛋白的分子对接在蛋白数据库（The Protein Data Bank，PDB，http://www.rcsb.org/）中获得度值最高的前5个靶点的PBD结构文件。从TCMSP 数据库中获得靶点最多的8 个有效成分的Mol 2格式文件（3D结构）。将获得的文件导入在线分子对接网站SwissDock（http://www.swissdock.ch/docking），依次分别进行高频靶点与核心成分的分子对接，分析活血疏肝汤中的有效成分与靶蛋白的亲和力。

2 结果

2.1 活血疏肝汤有效成分筛选通过TCMSP 数据库获取活血疏肝汤中8味中药的有效成分，剔除重复项后共获得有效成分196 个，其中132 个具有化学结构。

2.2 药物-成分-靶点网络的构建将获得的有效成分导入BATMAN数据库，获得693个有效靶点。依据活血疏肝汤的有效成分及靶点，构建药物-成分-靶点网络。见图1。

2.3 药物与疾病共有靶点的获得自CTD数据库中获得175个血栓靶点及38个疼痛靶点。自DisGeNET数据库获得36 个血栓靶点及209 个疼痛靶点。将靶点合并，获得TKA 术后血栓及疼痛靶点共计389 个。取药物靶点与疾病靶点的交集，获得79 个活血疏肝汤与TKA术后血栓及疼痛的共有靶点。

2.4 共有靶点的分析与筛选通过STRING 数据库对79个共有靶点进行PPI分析，将结果导入Cytoscape软件绘制PPI网络图，见图2。结果显示，79个靶点之间存在644 种相互作用，靶点的最高度值为50，平均度值为16.51。根据大于平均度值筛选出35个关键靶点，为IL6、AKT1、TNF、PTGS2、IL1B、EDN1、CRP、IL10、F2、FGF2、IL4、SERPINE1、ESR1、PPARG、TGFB1、CNR1、CAT、NR3C1、CTNNB1、VCAM1、OXT、IFNG、OPRK1、DRD2、AVP、ENSG00000196689、CYP3A4、HTR1A、SLC6A4、C3、BDKRB2、FASLG、NFKB1、HTR3A以及ABCB1。

2.5 GO 功能及KEGG 通路富集分析GO 功能富集分析结果主要分为生物过程（Biological Progress）、分子功能（Molecular Function）、细胞组成（Cellular Component）三个方面，主要涉及定位的维持（maintenance of location）、受体配体活性对细菌的反应（Receptor ligand activity response to bacterium）、细胞因子产生的调控（Regulation of cytokine production）、细胞对有机循环化合物的反应（Cellular response to organic cyclic compound）以及血液循环（Blood circulation）等，见图3。KEGG通路富集分析显示，涉及的主要通路依次为“hsa 05142:Chagas disease（American trypanosomiasis）”“hsa 05200:Pathways in cancer”“hsa 05140:Leishmaniasis”“hsa 04080:Neuroactive ligandreceptor interaction”“hsa 05205:Proteoglycans in cancer”以及“hsa 04066:HIF-1 signaling pathway”等，见图4。

图3 GO功能富集分析

图4 KEGG通路富集分析

2.6 核心成分与高频靶点的分子对接将PDB数据库中获得度值最高的前5 个靶点（IL6、AKT1、TNF、PTGS2、IL1B）与TCMSP 数据库中获得靶点最多的8个有效成分（beta-sitosterol、CLR、Supraene、betacarotene、Phytoene、icos-5-enoic acid、gadelaidic acid、7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5，6-g]quinoxaline-2,4-dione），依次分别通过SwissDock 获取其结合能，见图5。其中Phytoene、beta-carotene 与PTGS2 的结合能最小（＜-10 kJ/mol），其分子对接结果显示，有效成分与靶蛋白充分嵌合，具有较好的结合作用，见图6。

图5 高频靶点与核心成分对接结合能（kJ/mol）

图6 PTGS2分别与Phytoene（图a）和beta-carotene（图b）的分子对接结果

3 讨论

网络药理学是研究药物作用机制的有效途径，通过网络公共数据库或早期研究获得的数据来解释功能药物的作用机制。网络药理学研究策略符合中医对疾病完整性的认识[11-12]。分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法，主要研究分子间（如配体和受体）相互作用，并预测其结合模式和亲和力的一种理论模拟方法。活血疏肝汤作为中药复方，含有多种具有复杂化学结构的有效成分，通过不同作用靶点与多种作用途径，共同发挥其独特的临床功效。而正是由于活血疏肝汤作用机制的多面性，传统的药理学评价方法难以确定其具体作用。本研究通过网络药理学及分子对接技术揭示了活血疏肝汤对TKA 术后血栓及疼痛的治疗作用及可能的分子机制，为活血疏肝汤在TKA加速康复中的应用和有关机制的进一步研究提供参考依据。

3.1 活血疏肝汤有效成分抗血栓及镇痛的药理作用分析活血疏肝汤中含有的多种中药与抗血栓及镇痛作用密切相关。黄芩是一味被广泛应用的中药，具有抗炎镇痛等诸多生物学作用，对多种疼痛有治疗效果[13-14]。当归不仅具有抗炎镇痛作用，还具有抗血栓形成、抗血小板聚集、改善血黏度以及抗凝等生物学活性[15-16]。红花不但能抑制血小板聚集和预防血栓，甚至能溶解已形成的血栓，同时具有强烈持久的镇痛作用[17]。桃仁能通过抑制血小板聚集、改善血流动力学和抗炎症来实现抗血栓作用[18]。柴胡具有抗炎镇痛解热作用，以此实现术后镇痛[19]。在网络药理学分析中获得靶点最多的5 个有效成分分别为betasitosterol、CLR、Supraene、beta-carotene、Phytoene。Beta-sitosterol 是黄芩的主要有效成分，其通过干扰前列腺素代谢来拮抗炎症实现镇痛作用，并在动物实验中表现出明确的抗血栓活性[20-21]。CLR在红花中含量较高，作为四种肽类激素的同源受体，通过受体-配体相互作用影响血管内皮屏障完整性和血管生成，同时也与疼痛发生有关[22]。Supraene 是黄芩的主要成分，也是一种天然的生物相容性脂质体，本身并不具有镇痛或抗凝作用，但可与镇痛及抗凝相关药物结合后实现药物的缓释，从而增强药理作用[23]。Beta-carotene与Phytoene 同属于类胡萝卜素，是红花的主要有效成分，可以降低罹患许多疾病的风险，如心血管疾病、白内障形成、年龄依赖性黄斑变性及癌症[24-26]。

3.2 高频靶点与抗血栓及镇痛机制关联分析在PPI 网络中，度值最高的前5 个靶点被认为是活血疏肝汤治疗TKA 术后血栓及疼痛的枢纽基因，可能在TKA 术后加速康复中发挥重要作用。其中最值得注意的是，IL6 是TKA 术后炎症反应的重要指标及影响术后疼痛的重要炎症介质[27-29]。AKT1 被认为是治疗下肢深静脉血栓的关键基因，同时作为PI3K/Akt通路的关键分子与疼痛密切相关[30-32]。TNF 具有免疫调节、促炎作用，与术后疼痛密切相关且在下肢深静脉血栓形成中起关键作用[33]。PTGS2 又名COX-2，已证实可引起大鼠下肢深静脉血栓形成，同时也是TKA术后疼痛的主要靶点[34-35]。IL1B 是一种抗炎细胞因子，不但能缓解膝关节炎所致疼痛，也影响了下肢深静脉血栓的形成[29,36-38]。

3.3 活血疏肝汤抗血栓及镇痛机制分析Go功能富集分析挖掘了活血疏肝汤在TKA 术后抗血栓及镇痛等生物学过程中的作用机制，预测了活血疏肝汤作用于血栓形成及疼痛的靶点，提示其作用集中发生于细胞膜内外及细胞膜本身的脂阀，同时作用于内质网导致一系列的蛋白合成，并在此基础上通过受体与配体的相互作用，调控细胞因子的产生，影响血液循环，从而干预血栓与疼痛的病理学过程。KEGG通路富集分析则提示，活血疏肝汤主要通过调控肿瘤信号传导通路、神经活性受体-配体作用、肿瘤蛋白聚糖、缺氧诱导因子1 信号传导通路来实现TKA 术后抗血栓及镇痛的作用。

3.4 活血疏肝汤核心成分与TKA 术后血栓及疼痛高频靶点的结合分子对接可以评估配体和蛋白质在热力学上是否具有结合的能力，还能进一步预测活血疏肝汤的作用靶点。若结合能＜-5.0 kJ/mol，说明结合性好。结合能越小，结合的效果越好。活血疏肝汤的核心成分与TKA 术后血栓及疼痛高频靶点的分子对接结果显示各成分与靶点的结合能均＜-5.0 kJ/mol，说明所有核心成分与高频靶点均能获得良好结合。另外，PTGS2作为活血疏肝汤作用于TKA术后血栓及疼痛的典型受体，与Phytoene、Beta-carotene 及Supraene等核心成分的结合能均小于-10 kJ/mol，且分子结构嵌合紧密，说明活血疏肝汤的核心成分与疾病高频靶点具有良好的结合活性，以此实现TKA术后抗血栓及镇痛作用。

本研究以网络药理学及分子对接技术为基础，系统分析了活血疏肝汤治疗TKA 术后血栓及疼痛的可能机制。结果提示，活血疏肝汤中的主要有效成分在分子水平上通过多路径发挥药理作用，主要涉及肿瘤信号调控、抗缺氧、抗炎症等多种机制。本研究中，活血疏肝汤表现出良好的抗血栓及镇痛功能，提示活血疏肝汤具有成为治疗TKA 术后血栓与疼痛候选药物的潜力，也为其药物作用机制的进一步研究提供了理论基础。